急性肝内胆汁淤积幼鼠肠黏膜屏障损伤机制及益生菌对其干预的分析-儿科学专业论文.docxVIP

华中科技大学博士学位论文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE 1 PAGE 1 急性肝内胆汁淤积幼鼠肠黏膜屏障损伤机制及益生菌对其干预 的研究 华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科 研究生 刘圣烜 导 师 黄志华 摘 要 第一部分 急性肝内胆汁淤积性黄疸幼鼠肠黏膜屏障损伤机制的研究 目的：为模拟人体淤胆型肝炎建立 α-异硫氰酸萘酯(ANIT)诱导的急性肝内胆汁 淤积性黄疸的幼鼠模型，研究急性肝内胆汁淤积性大鼠小肠粘膜屏障的变化及其机 制。 方法：雄性三周龄 SD 大鼠 ANIT50mg/kg 一次性灌胃，建立急性肝内胆汁淤积 动物模型，于灌胃后 24、48、72 小时观察各组大鼠血清总胆红素（TB）和丙氨酸转 氨酶（ALT）的浓度， 并采用免疫组化和 Western blots 免疫印迹法检测末端回肠黏 膜紧密连接蛋白 ZO-1（Zonula occludens-1），闭锁蛋白（Occludin），以及两种细胞因 子核因子-κB （NF-κB）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分布和表达，并利用图像分 析系统对 Western blots 图像结果进行定量分析。 结果： 1. 灌服 ANIT 后，模型组大鼠血清 ALT、TB 逐渐升高，24h 增加明显，48h 达 到高峰，72h 开始下降。各时间点与对照组相比有明显差异（P0.01）。 2. ZO-1 和 Occludin 蛋白主要沿大鼠小肠黏膜上皮细胞膜的顶端呈线状分布， 模型组大鼠 24h 时 ZO-1 和 Occludin 的阳性染色较对照组减少，48h 减少最为明显， 72h 阳性染色有所恢复。Western blots 结果与免疫组织化学结果相一致。各时间点与 对照组相比有明显差异（P0.01）。 3. 模型组大鼠 NF-κB 和 TNF-α 蛋白表达与 ZO-1 和 Occludin 蛋白的表达呈负 相关，于 24h 开始升高，48h 达到最高点，72h 开始有所下降。Western blots 结果与免 疫组织化学结果相一致。各时间点与对照组相比有明显差异（P0.01）。 结论：ANIT 诱导的急性肝内胆汁淤积发生时，NF-κB 受刺激激活，导致炎症介 质 TNF-α 释放增加，TNF-α 可引起其他炎症介质释放增加并进一步再活化 NF-κB，触 发炎症介质的“瀑布样级联反应”从而导致炎症反应。由 NF-κB 和 TNF-α 介导的炎症 反应引起小肠黏膜上皮紧密连接蛋白分布异常及数量改变，影响肠黏膜上皮屏障的完 整性，破坏小肠黏膜屏障。 关键词：急性肝内胆汁淤积；紧密连接蛋白；肠黏膜屏障；核转录因子；炎症介 质 第二部分 益生菌对急性肝内胆汁淤积性黄疸幼鼠肠粘膜屏障影响 目的：研究双歧三联活菌（培菲康）对急性肝内胆汁淤积性大鼠小肠上皮细胞紧 密连接蛋白 ZO-1 和 Occludin 表达的影响以及对细胞因子 NF-κB 和 TNF-α 表达的影 响，从而探讨益生菌制剂对急性肝内胆汁淤积性黄疸幼鼠肠粘膜屏障的保护机制，为 益生菌制剂在临床中的应用提供理论依据。 方法：雄性三周龄 SD 大鼠随机分为对照组、模型组和培菲康组，模型组和培菲 康组均给予 ANIT50mg/kg 一次性灌胃，建立急性肝内胆汁淤积动物模型，培菲康组 于造模前 4 天开始给予培菲康 4.2×108 个活菌数/kg/d 灌胃大鼠。分别于造模后 24、48、 72 小时三个时间点处死大鼠，取腹主动脉血检测血清 TB 和 ALT 水平，并取末端回 肠黏膜组织，采用免疫组化和 Western blots 免疫印迹法检测紧密连接蛋白 ZO-1， Occludin，以及细胞因子 NF-κB 和 TNF-α 的分布和表达，并利用图像分析系统对 Western blots 图像结果进行定量分析。 结果： 1. 各时间点培菲康组大鼠血清 ALT、TB 较模型组明显降低（P0.05）。 2. 模型组大鼠 24h 时 ZO-1 和 Occludin 的阳性染色较对照组减少，48h 减少最为 明显，72h 阳性染色有所恢复，而培菲康组大鼠各时间点 ZO-1 和 Occludin 的阳性染 色和模型组相比均明显增多。Western blots 结果与免疫组织化学结果相一致，模型组 24h 已经开始下降，48h 达到最低，72h 开始恢复，各时间点与对照组相比有明显差异 （P0.01）；而培菲康组各时间点蛋白表达与模型组相应时间点数据相比有明显恢复 （P0.05）。 3. 模型组大鼠 NF-κB 和 TNF-α 蛋白表达较对照组于 24h 开始升高，48h 达到 最高点，72h 开始有所下降。Western blots 结果与免疫组织化学结果相一致。各时间 点与对照组相比有明显差异（P