食管鳞癌中DLL4、VEGF的表达及其临床意义探讨.doc

T3: 肿瘤浸润纤维膜 T4： 肿瘤浸润邻近结构 T4a：可切除的肿瘤浸润膈肌、近胸膜或近心包 相邻相邻 T4b：肿瘤不可切除的则侵润如气管、主动脉、近椎体等邻近结构， 相邻 区域淋巴结 Nx：不族能被评价的区域淋巴结 N0： 无区域淋巴结转移 N1：淋巴结 1-2 个区域出现转移 N2： 3-6 个区域淋巴结转移 N3： 等于或多于 7 个区域淋巴结转移 远处转移 M0： 无远处转移 M1： 远处转移 临床及病理分期组合： 主要化学物品、试剂及配制 （1）一抗：兔抗人 DLL4 多克隆抗体（浓缩型）购买自 Abcam 公司的。兔抗人 抗 VEGF 多克隆抗体（即用型）、鼠抗人抗 CD34 单克隆抗体（即用型）购买自 福州迈新（南京分公司）生物技术开发公司。 （2）二抗：HRP-Polymer 抗羊 IgG（PV-9003）购买自北京中杉金桥生物技术有 限公司。 （3）其他试剂：柠檬酸盐缓冲液（0.01M , pH 6.0）：称取柠檬酸三钠 3.0g，柠 8 檬酸 0.4g 溶于 1000ml 蒸馏水。 新鲜配制 DAB 溶液：称取 DAB30mg，用 Trs-HCL 缓冲液（0.05mol/L, pH7.6） 100ml 溶解。 TBS 缓冲液（100ml，pH=7.6）：称取 2.42g Tris 碱，8.18g NaCl 溶于 1000ml 蒸馏水。 磷酸盐缓冲液（PBS, 0.01M, pH 7.2~7.4）：称取氯化钠 8.0g，氯化钾 0.20g， 和二氢钾磷酸 0.20g，磷酸氢二钠 1.56g 溶于 1000ml 蒸馏水中。 （4）常用试剂配制 1）柠檬酸盐缓冲液 成分: 柠檬酸三钠 3.0g 柠檬酸 0.4g 配制方法：将上述试剂按照上述所记录剂量溶于蒸馏水(1L)中。 2）新鲜配制 DAB 溶液 新鲜配制 DAB 溶液：称取 DAB30mg，用 Trs-HCL 缓冲液（0.05mol/L, pH7.6） 100ml 溶解。 3）TBS 缓冲液（100ml，pH=7.6） 成分: Tris 碱 2.42g 配制方法：将上述试剂按照上述所记录剂量溶于蒸馏水(1L)中。 4）PBS（PH7.2，0.01M）： 成分: NaCl 8.0g KCl 0.2g Na2HPO4. 1.56g KH2PO4 0.20g 配制方法：将上述试剂按照上述所记录剂量溶于蒸馏水(1L)中，调 pH 值至 过滤后备用。 主要仪器 主要仪器 厂家 电子天平（AE200） 上海台衡仪器仪表有限公司 自动三重纯水蒸馏器（AZ-97） 上海精密仪器仪表有限公司 9 冰箱（美菱 BCD-181K） 安徽合肥美菱集团 石蜡切片机 莱比信（中国）科技发展有限公司 微波炉(普通型) 格兰仕电器（广东）有限公司 烘箱（KWY-450型电热干燥箱） 上海韩岛技术有限公司 高像素电子显微镜（Olympus AH-2型）日本 Olympus公司 免疫组织化学检测 DLL4、CD34、VEGF （1）将石腊包埋好的食管鳞癌组织及癌旁组织族块切成约 3～4μm 厚度，60～65℃ 烘箱内烤片约 4h，以防组织脱落； （2）切片脱蜡、水化：顺序依次为二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙 醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇、75%乙醇分别为 10 分钟； （3）PBS 缓冲液洗涤切片 5min×3 次； （4）石蜡切片食管鳞癌组织抗原的修复：我们采用用高压修复组织的方法来修 复，第一步将耐高温和高压的切片架放好，然后再放入尚未加热的柠檬酸盐缓冲 液中；盖好高压锅后将其放在我院购买的普通电磁炉上进行大火加热，从开始加 热到最后压力动锅喷气耗时大约需要 15min，从喷气开始时计算大约 2 分钟以后切 断电源让压力锅自然冷却，此过程大约需要 20 分钟； （5）采用 3%H2O2（以 PBS 缓冲液）滴加在组织切片上，室温（20～30℃）静 置，此过程大约需要 10 分钟； （6）PBS 洗 2～3 次，分别为 1 分钟； （7）每张切片滴加正常山羊血清约 50μl 封闭,室温静置 10～15 分钟，去除多余 液体。 （8）分别滴加一抗 DLL4 抗体（稀释倍数为 1: 300），VEGF、CD34 抗体放置在 湿盒中，4℃冰箱过夜，为防止切片干燥，予以 PBS 液体替代一抗作为本次试验 的阴性对照； （9）1×PBS 洗 3 次，时间分别为 5min； （10）滴加二抗（HRP-Polymer anti-Goat IgG），放在室温下静置，时间约 20 分 钟； （11）1×PBS 冲洗每张切片 3 次，时间为 1min*每次； （12）滴加显色液：配置好的 DAB 约 3ml 依次滴加，在显微镜下观察，掌握染 色程度，显色大约需要 3～5 分钟； （