蝰蛇缅甸亚种蛇毒凝血因子X激活物Fla的分离及其凝血活性研究-基础医学专业论文.docxVIP

目 目 录 缩写词 2 摘要 l 英文摘要 2 引 言 2 材料与方法 ．13 结 果 ．20 讨 论 ．3 l 小 结 ．36 参考文献 ．37 附件 ．43 致j射 ．47 摘 摘 要 目的：以蝰蛇(缅甸亚种)蛇毒干粉为研究对象，分离出一个具有凝血活性的组 分F I a，并对其凝血特点和机制进行了初步探讨。 方法：经过CM．Sephadex C．50阳离子交换层析，Sephadex G一75凝胶层析及在 Akta蛋白快速纯化系统上应用TSK—G2000 SWxl柱分离得到一个具有凝血活性 的组分F I a。以质谱测定其分子量，等电聚焦电泳测定等电点。用Williams和 Esnouf的方法测定F I a对人贫血小板血浆的凝血作用，用特异性底物法研究F I a 对凝血因子X(F X)和凝血酶原的激活作用。按Rong Gao和Manjunatha的方 法研究F I a对纤维蛋白原作用；用纤维平板法研究F I a对纤维蛋白的降解作用； 并测定不同温度、不同pH，以及不同抑制剂对F I a促凝血活性的影响：采用 PE公司的ABl49lA仪器测定F I aN端20个氨基酸的序列。 结果：经三步分离得到F I a，其血液凝固时间为290-a：5 s／31．25甥(n=3)。由l g 粗毒得到10．75 mg F I a，最终的回收率为1．1％。分子量为32，589 Da，等电点为 7．2。染色检测显示F I a为糖蛋白。F I a可激活凝血因子X，但不能激活凝血酶 原，不能降解纤维蛋白原和纤维蛋白。F I a发挥促凝效应的适宜pH为7．0～8．0， 适宜温度为30～500C；EDTA可以抑制F I a的活性，而PMSF对其活性无影响。F I a 的N端序列为NH2．V-I旬旬．D-E-C．N．I-N．E-H．P．F．L广A．L广M．VY。 结论：蝰蛇(缅甸亚种)蛇毒经过CM．Sephadex C．50阳离子交换层、Sephadex 75 凝胶层析、在Akta快速蛋白纯化系统上用TSK—G2000 SWxl柱再次凝胶层析分 离得到具有促凝作用的F I a，为单链糖蛋白，金属蛋白酶，其分子量为32，589 Da， 等电点为7．2左右；其促凝活性与激活FX相关；F I a促凝活性的适宜pH为 7．0～8．0，适宜温度为30-500C； N端20个氨基酸的序列为 NH2．V．I．G．G—D—E．C．N—I．N—E H P F—I，一A—I，．M—Y二Y。 Objective：To Objective：To purify and characterize the procoagulant protein F I a from Myanmar Daboia Russelli Siamensis venom powder,and study its procoagulant properties， mechanism and N·terminal sequence． Methods：F I a was purified from the venom of Myanmar Daboia Russelli Siamensis by ion-exchange chromatography on CM—Sephadex C-50，gel—filtrations on Sephadex 75 column and a TSK-G2000 SWxl column on Akta purifier system．Its molecular weight Was determined by MALDI—TOF—TOF·MS，and the isoelectric point was measured by isoelectric focusing electrophoresis．Procoagulant activity of Fla was determined by the method of Williams and Esnoufi The specific chromogenic substrates were used respectively to determine the activities of F I a on Factor X and prothrombin．Fibrinogen—clotting activity of F I a was determined by the method of Rong Gao and Manjunatha．The fibfinolytic activity of F I a was examed by a modified fibrin