硫酸乙酰肝素体外抗黑色素瘤作用-微生物与生化药学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 10 硫酸乙酰肝素的体外抗黑色素瘤作用 摘 要 目的：比较分析来源于两种乳腺癌细胞株的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS) 对人A375黑色素瘤细胞生长的影响及作用机制，进而探讨不同组织来源 的HS链的抗癌活性。 方法： 1、HS 链的提取、纯化 培养人乳腺上皮癌细胞 MDA-MB-231 及 MCF-7，收集汇合期培养液，DEAE-Sepharose-CL-6B 离子交换色谱分 析、透析、蛋白含量测定、硫酸软骨素酶化学降解、冷冻干燥。链霉蛋 白酶降解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan, HSPG） 的核心蛋白，得到 HS 链。SDS电泳分析，冷冻干燥备用。 2、HS 链的体外抗黑色素瘤实验 将 MDA-MB-231 及 MCF-7 型 HS 链以不同浓度作用于人 A375 黑色素瘤细胞，倒置显微镜下观察用药前后 受 试 细 胞 形 态 的 变 化 ； 噻 唑 蓝 (MTT) 法 检 测 细 胞 生 长 抑 制 率 ； Annexin-V-FITC 及 PI 双染法观察其对细胞凋亡的影响；活性检测法测 定用药前后细胞中 caspase-3 及 caspase-9 酶活性的变化情况。 结果： 1. HS 链可致 A375 细胞变圆、漂浮、空泡、轮廓模糊，大剂量组（MCF-7 型 HS 100μg/ml，MDA-MB-231 型 HS 1000μg/ml）出现了大量的细胞碎 片。 2. MTT 结果显示，不同浓度的 HS 均能抑制黑色素瘤细胞的生长 和增殖，与对照组比较有显著差异（P﹤0.01）；来源于 MCF-7 细胞与 MDA-MB-231 细胞的 HS 链分别在 100μg/ml 与 1000μg/ml 时对细胞的 抑制作用最强，作用 72h 后，最大抑制率分别为 81.56%与 62.63%。 3. 流式细胞术测定结果显示，HS 诱导细胞凋亡增加。25μg/ml、50μg/ml、 100μg/ml 的 MCF-7 型 HS 及 250μg/ml 、 500μg/ml 、 1000μg/ml 的 MDA-MB-231 型 HS 作用 24h 后，细胞早期凋亡率依次为 10.32%、 11.57%、17.52% 及 14.45%、12.25%、10.35%。 4. caspase 活性检测显 示，MCF-7 型 HS 作用于 A375 细胞 24h 后，促进了 caspase-3 及 caspase-9 的活化，与对照组比较有显著差异（P﹤0.05）；MDA-MB-231 型 HS 虽 促进 caspase-3 的活化，但随着剂量的增加，对 caspase-9 活化的能力反 渐降低。 结论：1. 两种乳腺癌细胞株来源的 HS 均可抑制人 A375 黑色素瘤细胞的生长 和增殖，诱导其凋亡。 2. HS 诱导 A375 细胞凋亡，与诱导肿瘤细胞 caspase-3 及 caspase-9 的活 化有关。 3. 来源于 MCF-7 细胞的 HS 具有较强的抗黑色素瘤作用。 关键词：HS 链； 人 A375 黑色素瘤细胞； MTT； 凋亡； caspase-3； caspase-9 The Antineoplastic Effects of HS Chains on Melanoma in vitro Abstract Objective：To compare and evaluate the antineoplastic actions and mechanisms of heparan sulfate(HS) chains from different cells on human A375 melanoma cells. Methods: 1. Isolation and purification of HS chains The conditional Medium in which human breast cancer cells (MCF-7 or MDA-MB-231) grew into confluence was collected and chromatographed by DEAE-Sepharose-CL-6B. The interesting components were collected and dialyzed against water. The products were digested by chondroitinase ABC as well as pronase after protein quantification followed by electrophoresis o