第八、九、十章感染性疾病的分子生物学检验.ppt

HBV基因组结构 HBV DNA是带有部分单链区的环状双链DNA分子，是目前已知感染人类最小的DNA病毒。 基因组长为3.2kb 长链称为负链用“L(-)”表示，长度是固定的，它携带有病毒全部的编码信息； 短链称为正链用“S(+)”表示，S(+)在不同的分子中长度不等，大约是负链的50%～100%。 粘性末端 DR区域是DNA成环及病毒复制的关键区域 HBV基因组负链DNA核苷酸序列上含有6个开放读码框架：S、C、P、X 、前-前-S和前-X 普通PCR技术 荧光定量PCR技术 支链DNA技术（核酸探针杂交标记信号放大技术。支链DNA（bDNA）是人工合成的带有许多侧链的DNA片段，在每个侧链上都可以标记可被激发的标志物。检测时，其靶核酸本身不被扩增） 核酸杂交技术 杂交捕获系统 基因芯片技术 乙型肝炎病毒的耐药性分析 最常用的抗HBV药物为核苷（酸）类似物，如拉米夫定（lamivudine）、阿德福韦（adefovir） 耐药性： HBV的高变异性（逆转录酶缺乏严格的校正功能） 人体免疫应答或疫苗接种等压力 拉米夫定--与dNTP竞争HBV DNAP（逆转录酶区）从而抑制复制起到治疗作用。 当HBV DNAP氨基酸序列发生改变使HBV DNAP与拉米夫定的结合能力明显下降，产生了对拉米夫定的耐药性。 PCR-RFLP PCR-RDB ELISA 基因芯片技术 人类免疫缺陷病毒的分型 HIV由于高错误率的逆转录酶、病毒的快速复制、宿主的免疫选择作用、不同毒株DNA之间的基因重组等原因，其基因具有很高的变异性。 目前，HIV分型的方法主要集中在env、gag和pol区的某一段基因片段的分析。常用方法有：序列分析法、异源双链核酸泳动实验、限制性片段长短多态性分析、DNA酶联免疫技术、基因芯片技术、多重PCR技术等。 人类免疫缺陷病毒的耐药性分析 耐药是抗病毒药物作用的病毒基因发生突变的结果。 HIV快速产生的耐药是影响治疗效果的主要因素。 已经确定的与6类艾滋病抗病毒药物耐药有关的HIV基因突变有200多个。 耐药性检测方法种类多，主要集中在耐药性突变位点的检测能力和耐药性突变位点的评价能力。 方法：基因芯片耐药检测、等位基因探针杂交、寡核苷酸链接分析法与直接测序法等。 第九章 细菌感染的分子生物学检验 结核杆菌Mycobacterium tuberculosis，TB WHO2009年全球结核病控制报告: 全球有1/3人口即17亿人感染了结核杆菌，每1秒钟就有1人受感染 全球现有肺结核病患者1370万，结核病每年发病人数为927万，每年死亡人数177万 结核病仍为单一病原菌引起疾病死因的第一位 发病人数占前五位的国家分别为印度、中国、印度尼西亚、尼日利亚、南非 TB 基因组结构 环状双链DNA，共有4403765bp（4.4Mb），G+C平均值65.6% 共有4033基因 功能已知的有1734个 605个基因编码的蛋白，可见于其他菌种，推测也在TB中存在（交叉） 1694个未知功能 耐药机制（药物抵抗） 酶： 药物水解酶 药物修饰酶（如：乙酰转移酶，很多药物外排泵系统） 壁：具有高度疏水的细胞壁，充当渗透屏障 TB 实验室检验技术 涂片染色镜检（痰涂片法阳性率低，只有20%~ 80%，易受其他抗酸性分枝杆菌的污染） 分枝杆菌分离培养（结核病诊断的“金标准”，但结核杆菌生长缓慢，增殖一代需10～18小时，生长成可见菌落一般需4～6周，不利于临床上的及时诊断和治疗） 分枝杆菌素试验（结核杆菌素试验如果呈阳性，也仅表示结核感染，并不一定代表患病） 血清学试验（分枝杆菌属各菌之间抗原有着广泛的交叉，特异性不强） 分枝杆菌药物敏感试验 分子生物学检验（分子生物学检验） TB 分子生物学检验方法 1. TB DNA检测 方法：PCR、real-time PCR、PCR-RFLP、线性探针杂交法(LPA)、链替代扩增技术(SDA)、扩增结核分枝杆菌直接试验(AMTDT)、基因芯片技术、测序等方法检测标本中的TB DNA PCR扩增所选靶序列 65kD抗原基因、MPB蛋白基因、rRNA基因、TB IS6110插入序列、染色体DNA的重复序列等 扩增产物用核酸杂交法进一步鉴定产物的特异性 TB 分子生物学检验方法 TB 分子生物学检验方法 2. TB 耐药性检测 对利福平（一线药）抗性的检测 靶基因为rpoB基因 90%～98%的耐利福平结核杆菌都检测到rpoB突变。rpoB基因全长3 543个碱基。当其中507～533位密码子(81bp)的核心区域——耐利福平决定区(RRDR)发生突变（点突变或短的插入、缺失突变）时，使DNA依赖性RNA聚合酶亚单位酶结构改变，利福平不能与细菌RNA聚合酶β亚单位结合而表