索拉菲尼对不同人肝癌细胞株抑制增殖及促凋亡作用的研究.docVIP

索拉菲尼对不同人肝癌细胞株抑制增殖及 促凋亡作用的研究 ：目的 探讨索拉菲尼对不同人肝癌细胞株抑制增殖、 促进凋亡作用及敏感性。方法体外培养肝癌细胞株Huh7、 MHCC97H. HepG2、SMCC7721. HepG2.2.15、PLC,各细胞 株分为实验组及对照组，以不同浓度索拉菲尼对实验组进行 干预，通过CCK8法检测出不同细胞株细胞凋亡的IC50值， 实验组与对照组再进行流式细胞学对比检测分析，进而得出 对索拉菲尼相对敏感及不敏感肝癌细胞株。结果索拉菲尼 对六种人肝癌细胞株PLC、HepG2?2?15、Huh7、HepG2、 MHCC97H. SMCC7721均有明显的促凋亡作用，对它们作用的 IC50 值 分 别 为 5. 3umol/L、5. 3umol/L、6.8umol/L、 7. Oumol/L^ 11. 7umol/Ls 15. 0umol/Lo 结论 索拉菲尼对 人肝癌细胞株 Huh7、 MHCC97H. HepG2、SMCC7721 . HepG2.2.15、PLC均有明显的抑制增殖和促凋亡作用，其作 用相对敏感细胞株和不敏感细胞株分别为PLC和SMCC7721o 关键词：索拉菲尼；肝癌；细胞株；凋亡 索拉菲尼(Sorafenib,商品名：多吉美)是一个多靶 点的分子靶向药物，对Raf-1激酶，VEGFR2、3, FLT3, Ret、 C-kit, PDGFR等靶点有抑制作用［1?3］。目前已有多项研 究证明索拉菲尼对晩期原发性肝细胞癌(HCC)有明显、确 切的疗效，能明显延长晚期肝癌的生存时间［4?6］。但在针 对索拉菲尼对不同人肝癌细胞株的各项实验研究结果中，其 对不同细胞株的作用效果存在差异［4, 7］。本研究以肝癌细 胞株 Huh7、MHCC97H. HepG2、SMCC7721、HepG2. 2. 15、 PLC为研究对象，通过实验得出它们不同的IC50值，并且选 出对索拉菲尼相对敏感及不敏感细胞株，为将来相关实验研 究的细胞株选择提供参考。 1资料与方法 1. 1 -般资料 人肝癌细胞株Huh7、HepG2、SMCC7721. PLC （中国科学院上海细胞库），HepG2. 2. 15购自上海复祥生 物科技有限公司，MHCC-97H （上海中山医院肝癌研究所）， CCK8试剂盒（美国Sigma公司），Annexin-PE/7-A凋亡检测 试剂盒（美国BectonDickinson公司），索拉菲尼（德国 拜耳免费提供）。 1. 2方法 1.2. 1细胞准备将各ITCC细胞株接种在含10%小牛血 清，1%青霉素、链霉素的DMEM培养基中，放置于37°C. 5%C02 培养箱中培养，细胞生长良好呈单层贴壁生长，将于对数生 长期的各株细胞计数并制成细胞悬液，，低倍显微镜下逐一 计数4大格的细胞数。计数板上每大格含16小格，计数时 每小格在上、左的压线细胞计入，而压线于下、右的细胞排 除不计。计数完成后按细胞密度公式计算：细胞悬液的细胞 数/ml二（四个大格子细胞数/4） X104 o反复操作细胞计数 3次取平均值以确保结果准确。每种细胞株设对照组（细胞 悬液+DMSO）、实验组（细胞悬液+索拉菲尼）。 1. 2. 2流式细胞学检测将浓度为2X 105/ml呈指数生长 的细胞悬液接种于6孔板，每孔2.5ml （即5X105/孔），细 胞培养箱内孵育Id,对照组每孔加入0. 5mlDMSO,实验组每 孔加入索拉菲尼0. 5ml溶液（终浓度为4uM）,每组设三个复 孔，然后置培养箱内孵育3d,不含EDTA的胰酶消化收集、 离心细胞，PBS液洗涤2次（每次均以2000rpm离心5min）, 以500ul的Binding Buffer重悬细胞，先后加入5ul Annexin V-FITC 和 5ul Propidium Iodide,混匀,室温避光反应 lOmin, 在lh内上流式细胞仪检测记录结果。流式细胞仪参数设定: 激发波长 Ex=488nm,发射波长 Em=530nm； Annexin V-FITC 的绿色荧光和PI红色荧光分别通过FL1和FL3通道检测。 1. 2. 3CCK8法检测 每种细胞设空白组（培养液+CCK—8）、 对照组（细胞+培养液+CCK-8）、实验组（细胞+培养液+索拉 菲尼+CCK-8）o调整细胞悬液浓度为5X107/L, 96孔板中每 种细胞各组设4个不同索拉菲尼作用浓度，每个浓度设3个 复孔，对照组内加入培养液200ul,实验组内加入不同量的 索拉菲尼溶液，余量液体用培养液补足，使每孔液体量为 200ul,在细胞培养箱内孵育24h；各组每孔加入lOulCCK-8 溶液，放入细胞培养箱内孵育2h。酶标仪在450nm波长比色 测定每孔吸光度（A）值，记录结果。细胞存活率（％）