肝细胞癌血管生成拟态的临床意义及身分子机制分析.docx

天津医科大学博士学位论文中文摘要 天津医科大学博士学位论文 中文摘要 研究目的 1．研究基质型血管生成拟态(vaseulogenie mimicry，VM)在肝细胞癌 (hepatoeellular carcinoma，HCC)(简称肝癌)中表达，结合临床病理及随访资 料加以分析，探讨VM在肝癌中表达的临床意义。 2．研究不同转移潜能人肝癌细胞株HCCLM3、MHCC97．H和MHCC97．L(转移 潜能由高到低)体内、外形成VM的差异，并利用血管生成、细胞外基质与粘 连分子基因芯片筛选细胞间差异表达的基因，以探索VM血管生成及细胞外基 质相关机制。 3．探讨两种基因芯片所筛选差异表达基因之血管生成相关基因Jagged 1和细胞 外基质相关基因骨桥蛋白(osteopontin，OPN)在肝癌VM形成中的作用。 研究方法 1．收集临床病理资料完整的151例肝癌组织标本，采用层粘连蛋白、CD34和 Hepatocyte免疫组织化学染色以及透射电镜技术检测肝癌组织中基质型VM表 达，并分析其与肝癌临床病理指标及生存预后的关系。 2．建立HCCLM3、MHCC97．H、MHCC97．L三维培养体系，倒置显微镜及过碘 酸席夫染色观察体外VM形成差异。建立裸鼠肝癌皮下移植瘤模型，研究 HCCLM3、MHCC97．L体内形成VM的差异。三维培养24 h后，应用Oligo血 管生成、细胞外基质与粘连分子基因芯片筛选MHCC97．H和MHCC97．L中差异 表达的基因，并采用逆转录．聚合酶链反应(R1凹CR)和Western-Blot验证部分 差异表达的基因；应用血管生成、细胞外基质与粘连分子Real—time PCR芯片对 HCCLM3和MHCC97．L进行差异表达基因筛选。 3．应用RNA干扰技术干扰Jagged 1和OPN表达，Real-time PCR、Western-Blot 及免疫荧光方法检测干扰效果：三维培养观察干扰后肝癌细胞株MHCC97．H VM 形成变化；免疫组织化学方法检测Jagged 1和OPN在肝癌组织中的表达，并分 析其与VM在肝癌组织中的表达相关性。 研究结果 1．151例肝癌组织中基质型VM阳性31例。组织中基质型VM阳性肝癌患者相 比阴性患者，肿瘤较大，血管侵犯率高，Edmondson分级高，pTNM分期晚。 基质型VM阳性患者和基质型VM阴性患者1、3、5年总生存率分别为67．7％、 天津医科大学博士学位论文34．6％、11．5％和86．7％、64．7％、40．3％(尸≮O．001)。单、多因素分析显示，多发 天津医科大学博士学位论文 34．6％、11．5％和86．7％、64．7％、40．3％(尸≮O．001)。单、多因素分析显示，多发 肿瘤、血管侵犯和基质型VM表达是影响总生存率的独立危险因素。 2．三维培养24 h，HCCLM3、MHCC97．H、MHCC97．L及HUVECs均形成血管 样结构，HCCLM3、MHCC97．H、MHCC97．L形成的血管样结构长度逐渐缩短。 裸鼠皮下移植瘤组织中，HCCLM3形成VM阳性率高于MHCC97一L。在Oligo 基因芯片筛选出的6个差异表达的血管生成相关基因中，MHCC97．H表达较 MHCC97．L上调的有4个，下调的有2个。在Oligo基因芯片筛选出的10个差 异表达的细胞外基质与粘连分子相关基因中，MHCC97．H表达较MHCC97．L上 调的有7个，下调的有3个。部分差异表达的基因RT-PCR与Western．Blot验证 结果与基因芯片结果一致。在Real—time PCR芯片筛选出的21个差异表达的血 管生成相关基因中，11个基因在HCCLM3中表达较MHCC97．L明显上调，10 个基因明显下调。在Real—time PCR芯片筛选出的20个差异表达的细胞外基质 与粘连分子相关基因中，13个基因在HCCLM3中表达较MHCC97．L明显上调， 7个基因明显下调。Oligo基因芯片所筛选出的差异表达基因与Real．time PCR芯 片变化趋势一致， 3．应用RNA干扰技术干扰Jagged l和OPN后，Real。time PCR、Western．Blot 和免疫荧光方法所测基因及蛋白表达水平明显下降；三维培养条件下，干扰后 的MHCC97．H不能形成明显的血管样结构；免疫组织化学检测显示Jagged 1和 OPN表达于肝癌胞浆中，肝癌组织中Jagged 1和OPN表达与VM成正相关关系。 研究结论 1．人肝细胞癌中存在基质型VM，其表达与肿瘤大小、分级、分期、血管侵犯 有关，是影响肝癌患者预后不利的独立危险因素。 2．高转移人肝癌细胞株体内、外形成VM能力明显较低转移人肝癌细胞株强， 其原因可能与高转移人肝癌细胞株差异表达某些血