基因组重测序第二讲 基因组比对.pptx

基因组重测序Bwa比对到参考基因组~/software/package/bwa-0.7.15/bwa memUsage: bwa mem [options] idxbase in1.fq [in2.fq]参数详解-t线程数-R 头文件信息 “@RG\tID:A\tLB:A\tPL:ILLUMINA\tSM:A”-M 剪接性比对（split alignments)，将 shorter split hits 标记为次优Sam文件说明SAM是一种序列比对格式标准， 由sanger制定，是以TAB为分割符的文本格式。主要应用于测序序列mapping到基因组上的结果表示SAM分为两部分，注释信息（header section）和比对结果部分（alignment section），注释信息可有可无，都是以@开头，用不同的tag表示不同的信息，主要有@HD，说明符合标准的版本、对比序列的排列顺序；@SQ，参考序列说明；@RG，比对上的序列（read）说明；@PG，使用的程序说明；@CO，任意的说明信息。Sam文件说明QNAME，比对片段的（template）的编号；FLAG，位标识，template mapping情况的数字表示，每一个数字代表一种比对情况，这里的值是符合情况的数字相加总和；RNAME，参考序列的编号，如果注释中对SQ-SN进行了定义，这里必须和其保持一致，另外对于没有mapping上的序列，这里是’*‘；POS，比对上的位置，注意是从1开始计数，没有比对上，此处为0；MAPQ，mappint的质量；CIGAR，简要比对信息表达式（Compact Idiosyncratic Gapped Alignment Report），其以参考序列为基础，使用数字加字母表示比对结果，比如3S6M1P1I4M，前三个碱基被剪切去除了，然后6个比对上了，然后打开了一个缺口，有一个碱基插入，最后是4个比对上了，是按照顺序的；RNEXT，下一个片段比对上的参考序列的编号，没有另外的片段，这里是’*‘，同一个片段，用’=‘；PNEXT，下一个片段比对上的位置，如果不可用，此处为0；TLEN，Template的长度，最左边得为正，最右边的为负，中间的不用定义正负，不分区段（single-segment)的比对上，或者不可用时，此处为0；SEQ，序列片段的序列信息，如果不存储此类信息，此处为’*‘，注意CIGAR中M/I/S/=/X对应数字的和要等于序列长度；QUAL，序列的质量信息，格式同FASTQ一样。/wiki/tiki-index.php?page=SAMhttp:///wiki/tiki-index.php?page=SAM/wiki/tiki-index.php?page=SAM Sam文件过滤根据SAM文件第二列的Flag信息，我们可以挑出一对reads都正确align到基因组上，而且方相匹配又距离合适的比对结果：Sam文件排序（sort）由BWA生成的sam文件时按字典式排序法进行的排序（lexicographically）进行排序的（chr10，chr11…chr19，chr1，chr20…chr22，chr2，chr3…chrM，chrX，chrY），但是GATK在进行callsnp的时候是按照染色体组型（karyotypic）进行的（chrM，chr1，chr2…chr22，chrX，chrY），因此要对原始sam文件进行reorder。可以使用picard-tools中的ReorderSam完成。bam文件是sam文件的二进制格式，占据内存较小且运算速度快基本用法：Java –jar picard.jar SortSamjava -XX:ParallelGCThreads=5 -Xmx5g -Djava.io.tmpdir=tmp -jar /home/software/picard/picard-2.9.0/picard.jar SortSam VALIDATION_STRINGENCY=LENIENT INPUT=A.filter.sam.gz OUTPUT=A.filter.sort.bam SORT_ORDER=coordinate Marking Duplicates 在制备文库的过程中，由于PCR扩增过程中会存在一些偏差，也就是说有的序列会被过量扩增。这样，在比对的时候，这些过量扩增出来的完全相同的序列就会比对到基因组的相同位置。而这些过量扩增的reads并不是基因组自身固有序列，不能作为变异检测的证据，因此，要尽量去除这些由PCR扩增所形成的duplicates，这一步可以使用picard-tools来完成。 去重复的过程是给这些序列设置一个flag以标志它们，方便GATK的识别。还可以设置 REMOVE_