生物医学工程技术Chapter 4 Light Microscope and Organic Fluorescence Probes.ppt

3. Fluorescence probes based on FRET FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) p130 4.3 Green fluorescent protein p131 绿色荧光蛋白（GFP）是Shimomura等人从水母（Aequorea Victoria）中发现的，它一种能发射荧光的特殊蛋白质，由238个氨从酸组成。分子质量为27KDa。GFP在氧分子的参与下可以高效率地发射内源性荧光，而不需要任何的外源底物或者辅助因子。 GFP，桶状结构，直径24?，高度42?。11条β折叠的肽链组成圆筒壁，1条α螺旋的肽链沿圆桶对角线分布，荧光团附着在α螺旋结构上。GFP的荧光性能取决于分子的一级结构，整个肽链围绕荧光团的精确折叠保证GFP独特的荧光性质。 下村修和他的同事发现水母素发出的蓝色冷光(λemmax = 470nm)与GFP激发光谱的波长(λexmax = 460nm)相匹配,而GFP发射光谱的波长大约510nm (λemmax: 508～515nm) 。Aequorea victoria发出绿光的机理:首先直接由水母素内的化学反应激发电子，然后进行无辐射能量转移,以激发GFP内的电子,然后使电子在返回基态时发出绿光。这是物理化学中已知的荧光共振能量转移( FRET)在生物体系中的体现。 漫谈绿色荧光蛋白 ———2008年度诺贝尔化学奖 GFP折叠成为近似天然构象（前提），然后Gly67的酰胺亲核进攻Ser65的羧基，接着环化和脱水形成咪唑啉酮（无荧光），最后分子氧使Tyr66的α,β-键脱氢，从而使它的芳基和咪唑啉酮共轭(对羟基亚苄基咪唑啉酮)。只有在这个阶段，发色团（Chromophore）才能吸收可见光并发出荧光。 Ser–Tyr–Gly, 丝氨酸–酪氨酸–甘氨酸 发光机理 P136 作为标记物具有以下特点：荧光强、检测非常方便；而且荧光非常稳定，可以承受诸如热、碱性pH、长时间光照、有机试剂和很多生物梅等因素的影响；最要的是它的荧光团是分子内自催化形成的，不需要其他辅助因子和反应底物的参与。 缺点：荧光团形成较慢，需要氧分子的辅助，并且在低浓度时很容易受到生物休系背景荧光的于扰；另外与小分子探针相比，它的体积过大，在某些研究中对体系的干扰很大。从而限制了它的应用。 （经基因改造获得的由红至绿的荧光蛋白，图片来自香港中文大学） The Application of GFP in Molecular Biology 作为报告基因的应用 作为融合标签的应用 作为生物传感器的应用 p136 稳定转染ERβ和GFP的MCF-7细胞 ×400. A 光镜下的MCF-7/GFP细胞, B. 荧光显微镜下的MCF-7/GFP细胞, C 光镜下的MCF-7/ERβ-GFP细胞, D 荧光显微镜下的MCF-7/ERβ-GFP细胞 荧光探针和绿色荧光蛋白知识小结 掌握荧光，有机荧光染料的发光原理和荧光显微镜的工作原理 金属离子的生物学功能； 掌握金属离子荧光探针的设计及工作原理 掌握Na离子金属荧光探针的工作原理 了解活性物质的测试原理 掌握FRET的物理学内涵及发生的条件 掌握绿色荧光蛋白的功能结构及发光机理 掌握绿色荧光蛋白的光学性质及生物应用 * Chapter 4 Light Microscope and Organic Fluorescence Probes History of microscope In 1665, R. Hooke, England; 17 century, Lee Wenhock, Netherlands, light microscope (第一扇门) In 1932, Ernst Ruska and Max Knoll, Germany, Transmission Electron Microscope (TEM) (1986) In 1935, M. Knoll, Germany, Scanning Electron Microscope (SEM) (第二扇门) 1982,G. Binnig and H. Rohrer, Switzerland，Scanning Tunneling Microscope (STM); 1986, Atomic Force Microscope (AFM) (1986) (第三扇门) ……… The Theory of Magnification of Lens 当L1≥2f，M≤1；fL12f，M1。 Light Microscope, Magnification Magnification M is the product of the ma