【培训课件-临床基因组学】_第四章 荧光原位杂交技术-广州医学大学.pptVIP

间期FISH 中期FISH 第4章荧光原位杂交技术 原位PCR CONTENTS 目录 FISH检测的基本原理 FISH检测的流程 FISH检测的临床应用 概念 原位杂交( in situ hybridization, ISH )是应用生物化学中核酸分子杂交的原理,在组织切片、细胞涂片或印片上原位检测某种DNA或RNA序列的一项技术。 1969年美国耶鲁大学Gall等首先通过基因探针将核糖体基因在爪蟾卵母细胞上进行定位。 概念 原位杂交( in situ hybridization, ISH )是应用生物化学中核酸分子杂交的原理,在组织切片、细胞涂片或印片上原位检测某种DNA或RNA序列的一项技术。 1969年美国耶鲁大学Gall等首先通过基因探针将核糖体基因在爪蟾卵母细胞上进行定位。 1.已知的单链核酸作为探针（直接法直接标记探针）； 2.按照碱基互补的原则，探针与待检材料中未知的单链核酸结合； 3.特异亲和素进行荧光标记； 3.使探针再用含荧光素标记的特异亲和素进行免疫化学反应； 4.荧光显微镜观察荧光信号。 相当于免疫学中 抗原－抗体的反应 FISH是一种“钓鱼”技术； 通过荧光标记的探针与细胞核内的靶序列杂交 获得细胞内多条染色体或多种基因状态的信息 始于20世纪80年代 按杂交对象： 组织 细胞 染色体 按探针标记物 同位素（放射性）标记探针 非同位素标记探针 荧光标记：最常用的为生物素、地高辛(Digxigenin , DIG)、罗丹明（Rhodamine）、荧光素（Fluorescence）、PI 、DAPI 酶标：如辣根过氧化酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)等。 按细胞周期来分 间期FISH 中期FISH 是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试剂 探针的碱基序列是已知的，只能与特定的核酸分子结合上。 用于原位杂交的探针有不同种类，可用于不同靶核酸的探测。 FISH探针定义 1）同位素原位杂交(Isotopic in situ hybridization) ——70年代 2）非同位素原位杂交(Non-isotopic in situ hybridization) ——80年代中后期 1）免疫酶联 2）荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH)**同位素原位杂交的不足之处：1）不稳定；2）高背景；3）曝光时间长；4）结果统计学处理繁琐。 5）同位素的使用和处理 荧光原位杂交（FISH）的原理 以BCR/ABL为例 正常信号模式为：2G2R（如左图） 典型阳性信号模式为：1G1R2F （如右图） 标记位点：红:ABL(9q34) 绿:BCR(22q11) G代表绿色信号，R代表红色信号，F代表融合信号。 基因片段扩增 1 基因片段缺失 2 基因片段倒位、易位等 3 1、安全、可靠； 2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用； 3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确； 4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度接近放射性探针； 5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列； 6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。 优点 FISH探针类型 重复DNA序列 单拷贝或低拷贝的DNA序列 基因组DNA 重复DNA序列探针 重复DNA序列、多基因家族作为探针与染色体原位杂交。容易产生较高的分辨率。因为这些DNA多拷则序列在染色体上可达几十个kb或几个Mb。日前所使用的这类探针有45S rDNA,5S rDNA、着丝点序列、端粒 序列、亚端粒序列、转座子等。 单拷贝或低拷贝DNA探针 这类探针包括某个基因的DNA克隆. RFLP或RAPD标记。这些探针DNA序列一般只有1-2kb.因而这类标记的原位杂交存在几个方面的困难: 1)需要用多层抗体结合来放大杂交信号 2)杂交信号很弱时.难以与背景信号区分 3)能够显示杂交信号的细胞比例很低 基因组DNA探针 利用不同基因组DNA同源性程度的差异。在原位杂交中只标记某一基因组或某个物种的基因组DNA。 在杂交中标记的基因组DNA首先与其完全同源的DNA杂交。 可以检测出导入异源多倍体的外源染色体或染色体片段，同时可以清楚地显示出易位与交换的位置。 1．重复序列探针 (1)着丝粒探针 此类探针的杂交靶常大于1Mb，探针与靶DNA结合紧密，杂交信号强，易于检测。主要用于检测染色体的数目，鉴定单体、三体、多体、多倍体以及标志染色体等染色体异常。 按染色体上位置分类探针 (2)异染