食品免疫学免疫检测关键技术与食品安全检测.docVIP

第八章 免疫学技术 第一节 抗原抗体制备 一、抗原制备 制备特异性抗原是制合格抗体前提条件，而作为检测诊疗抗原也必需是纯化抗原。抗原物质很多，极少是单一成份，必需从复杂组分中提取分离。 按抗原物理状态，可分为天然抗原、人工抗原和合成抗原三类。 1、天然抗原制备 （1）颗粒性天然抗原 常见颗粒抗原包含动物、植物、微生物细胞，和相关细胞组成结构，如细胞细胞壁、线粒体，细菌鞭毛和菌毛等。 通常步骤为：首先搜集抗原细胞或（和）扩增培养，然后离心或过滤搜集细胞或细胞组成结构物，再进行病原微生物灭活。 （2）可溶性抗原分离纯化 蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好可溶性抗原，免疫前常需纯化。 细胞破碎方法有：冻融法；超声破碎；高速组织捣碎机法；研磨法；溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶处理 可溶性蛋白抗原分离方法： 离心分离法：差速离心、密度梯度离心 选择沉淀法：盐析沉淀法；有机溶剂沉淀法，常采取乙醇或丙酮 核酸去除法，DNA酶、RNA酶处理； 水溶性非离子型聚合物沉淀法：常见非离子型聚合物为分子量为～6000聚乙二醇（PEG） 凝胶过滤法 ：又称分子筛层析。经过凝胶分子筛作用，可将大、中、小三类分子分开，选择凝胶柱时应注意选择适于分离范围内凝胶。 离子交换层析法：离子交换层析是利用部分带电离子基团凝胶或纤维素吸附带有相反电荷蛋白质抗原。 亲和层析法：亲和层析是利用生物分子间所含有专一性亲和力而设计层析技术。如抗原和抗体、酶和酶抑制物、酶蛋白和辅酶、激素和受体、DNA和RNA等之间有特殊亲和力，一定条件下，二者可紧密结合成复合物，如将复合物一方固定于固相载体上，则可从溶液中分离和提纯另一方。 纯化抗原判定 　　关键对纯化抗原含量、理化性质、纯度及免疫活性进行判定，常见方法有酚试剂法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、免疫电泳法、免疫双扩散法等。 2、人工抗原制备 人工抗原指经过人工修饰半抗原，立即半抗原和载体连接后形成完全抗原。 小分子半抗原能够是多糖、多肽、核酸、类固醇激素、一些药品及其它化学物品。 在食品检验中常见小分子半抗原有多种农药、兽药、添加剂和非法添加物（盐酸克伦特罗）、真菌毒素等等。 常见载体：蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物。 蛋白质：常见牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）、卵清白蛋白（OVA）、人血清白蛋白（HSA）、兔血清白蛋白（RSA)。 多肽聚合物：常见多聚赖氨酸。 大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纤维素(CMC)等皆可和半抗原结合，加入弗氏佐剂课产生良好抗体。 连接方法： 物理法 是用物理吸附法将载体和半抗原连接，其原理是经过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体关键有PVP和CMC等； 化学法 是利用一些功效基团把半抗原连接到蛋白质类或多肽类聚合物载体上。不一样半抗原应选择不一样方法进行连接。 依据半抗原拥有化学基团不一样，连接方法关键有以下几类： ①带游离氨基或羧基和二种基团皆有半抗原：羧基可用混合酸酐法和碳二亚胺法和载体氨基形成稳定肽键，带氨基半抗标准可和载体羧基缩合。 ②带有羟基、酮基、醛基半抗原：不能直接和载体连接，需要用化学方法如琥珀酸酐法、O-（羧甲基）羟胺法等方法将之转变为带有羧基半抗原衍生物后才能和载体连接。 ③带有酚基半抗原：可用一氯醋酸钠法或重氮化对氨基苯甲酸法，生成带有羧基半抗原衍生物。 3、免疫佐剂 一些物质和抗原一起或先于抗原注入机体，可增强机体对该抗原特异性免疫应答或改变免疫应答类型，这类物质称为佐剂(adjuvant) 。 应用最多佐剂为福氏佐剂 福氏不完全：石蜡油+羊毛脂 福氏完全：石蜡油+羊毛脂+卡介苗 乳剂制备： 乳剂：抗原和佐剂混合物 抗原和佐剂百分比为1:1，注射前要充足乳化 二、多克隆抗体制备 1、免疫动物选择 选择动物时应考虑以下原因： 抗原起源和动物种属关系。抗原起源和免疫动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。 动物个体选择。适龄、健康、体重符合要求正常动物（以雄性为佳）； 抗体用途和量：抗体需要量少时，选择家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选择绵羊、山羊、马、驴等大动物。 2、免疫方法 选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫路径、免疫次数、免疫间隔等原因。 痹。 （1） 免疫原剂量：免疫原接种剂量按免疫原性强弱、动物个体状态和免疫时间来确定。 小鼠首次剂量50-400 ug/次。大鼠：100-1000 ug/次。兔子：200-1000 ug/次。加强免疫剂量为首次剂量1/5-2/5。 （2） 免疫路径和免疫间隔时间 免疫路径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结等，视不一样免疫方案而异。对于不易获取宝