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蛋白质的分离纯化 主要参考书 1 《蛋白质化学导论》 孙崇荣 （复旦大学出版社） 2 《蛋白质化学研究技术与进展》 夏其昌 （科学出版社） 常用的蛋白质数据库 //www.espasy.ch/swissmod/ /// ///pdb/ 1 材料获得：天然获得； 基因工程手段 获得。 2 粗分离：除去大量杂质和杂蛋白，初步 浓缩目的蛋白。 3 细分离：常压柱层析 （ 1 ）分子筛层析 （ 2 ）离子交换层析 （ 3 ）疏水层析 （ 4 ）亲和层析 4 电泳： SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电 聚焦电泳，双向电泳。 5 蛋白质鉴定 （ 1 ）蛋白质纯度鉴定 （ 2 ）蛋白质浓度测定 （ 3 ）蛋白质活性测定 蛋白质的结构研究 一级结构： （ 1 ）氨基酸组成分析 （ 2 ）末端分析 （ 3 ）肽谱分析 二级结构： （ 1 ）紫外光谱法 （ 2 ）荧光光谱法 （ 3 ）红外光谱法 （ 4 ）圆二色性法 (CD 谱 ) （ 5 ）激光拉曼光谱法 高级结构： （ 1 ） X －射线衍射法 （ 2 ）核磁共振法 (NMR) 蛋白质结构与功能的关系 1. 突变 2. 晶体分析 3. 蛋白与蛋白的相互作用 一 . 材料获得 （一）天然材料： 新鲜，含量丰富，易于提取，价格便宜。 e.g. 钙调素：动物的脑组织，植物花粉 胰蛋白酶抑制剂：大豆种子 溶菌酶：鸡蛋清 抗体：血清 （二）基因工程产物： 对于天然不易得到的蛋白，通过工程菌或工程 细胞表达而获得。 1 原核细胞表达 大肠杆菌 表达载体： 目前较常用的是具有可诱导的 T7 启动子的表达载 体，大部分蛋白均可获得表达而且表达量较高，表达量可占 细菌总蛋白的 25 ％以上。 T7 － RNA 聚合酶的活性高于大肠杆菌 RNA 聚合酶，它只识别自己的启动序列，不能启动大肠杆菌 DNA 的转录，对抑制大肠杆菌 RNA 聚合酶的抗生素如利福平有 抗性，因而可在利福平存在的条件下，使目的基因得到大量 扩增。 宿主菌： 细菌染色体上含有噬菌体 T7 － RNA 聚合酶基因，它的 启动子为 Lac 启动子，可被 IPTG 诱导。 融合蛋白： 常用 6 － 10 组氨酸－融合蛋白，只增加几个氨基酸， 对蛋白质结构影响较小。 GST －融合蛋白，选择大肠杆菌偏爱 的密码子，容易表达外源蛋白。融合蛋白往往有利于表达和 纯化。 用途 ： 制备抗体，生化性质研究，结构研究。 优点： 操作简单，产量高，成本低。 缺点： 表达产物缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能 缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 培养条件： 根据不同研究目的，选择培养条件。 如制备抗体只需得到 包涵体 ，因为包涵体容易纯化 而且制备抗体不需活性蛋白。包涵体是细菌大量表 达外源蛋白时，由于蛋白形成过多过快而不能正常 折叠而形成的不溶性颗粒。 生化性质研究和结晶需要有活性的可溶性蛋白， 需要选择培养条件如低温，降低表达速度，添加辅 助因子，改变宿主菌等。 E. Coli vector Different protein expression in E. coli Activity curve of expressed protein from E.coli 2 真核细胞表达 （ 1 ）酵母 表 达 载 体 ： 诱 导 型 载 体 如 pBM150( GAL1 启 动 子 ) ， pAM82( PHO5 启动子 ) ； 组成型载体 pAAh5( ADH1 启动子 ) 。 宿主细胞： 营养缺陷型菌株如 URA3 － ， LEU2 － ， HIS3 － ， TRP1 － 等。 （ 2 ）动物细胞 表达载体： SV40 复制起点 , （ CMV 或 SV40 ）病毒启动 宿主细胞： 人 Hela 细胞，猴 COS 细胞，小鼠 3T3 细胞等 （ 3 ）植物细胞