园林植物组织培养 (5).pdf

2、DNA连接酶 2.1 概念 能催化dsDNA切口处5’-磷酸根和3’-羟基生成磷酸二酯键 ，将 两段核酸连接起来的酶 2.2 T4 DNA连接酶作用机制 – ①ATP+DNA ligase (E)→ E-AMP+PPi – ②E-AMP上的AMP转移到DNA 5′磷酸根上使其活化，释放 出酶 – ③活化的5′磷酸根与相邻的3′羟基形成3′ ，5′ －磷酸二酯键， 并释放出AMP 2.3 DNA连接酶基本用途 修复dsDNA缺口处的磷酸二酯键 修复RNA结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键 连接多个平头双链DNA分子 2.4 种 类  T4 DNA连接酶  大肠杆菌DNA连接酶  均可催化带粘性末端dsDNA片段间连接, 形成磷酸二酯键  均不能催化ssDNA之间连接反应  T DNA连接酶可催化具平齐末端的dsDNA片断连接 ；后者 4 无此活性 2.5 DNA连接酶反应条件 Tris-HCl 50-100mmol/L pH7.5 MgCl2 10mmol/L ATP 0.5-1 mmol/L DTT 5mmol/L Volume to 10-20μL Temperature 4-16℃ Time 4-16h 2.6 影响连接的因素 1 ）插入片段与载体的浓度比例 • 3-10倍：增加插入片段与载体接触机会，减少载体自我连接 2 ）反应温度 • 连接酶反应最佳温度37C ，但37℃下粘性末端结合不稳定 • 一般采用 4-16 C ：16 C反应4h ，而4 C反应需过夜 • 有些公司T DNA连接酶在25 C也能很好工作 4 2.7 平头双链DNA片段连接 从分子动力学角度，由RE酶创造的粘性末端连接属于分子内部连 接 ，而平头末端连接则属于分子间连接 ，因此后者反应速度慢 提高平头末端连接效率的方法： • 加大连接酶量 （10倍大于粘性末端的连接） • 加大平头末端底物浓度 ，增加分子间碰撞机会 • 加入10%PEG8000 ，促进大分子间有效作用 • 加入单价阳离子 （NaCl ）,最终浓度150-200 mmol/L 3、DNA聚合酶 3.1 大肠杆菌DNA聚合酶 I 性质 • 单链多肽，大小109kDa • 3种活性 5’-3’DNA聚合酶活性 5’-3’核酸外切酶活性 3’-5’核酸外切酶活性  5’→3’DNA聚合酶活性 条件：ssDNA模板、 3 ’OH基（引物或5 ’突出dsDNA ）、 Mg2+、dNTPs 5’粘性末端 5’→3’外切核酸酶活性 底物: dsDNA or DNA: RNA杂交体 活性：从5’端降解dsDNA 也降解RNA:DNA中的RNA(RNase H 活性)  3’→5’外切酶活性 条件：3’OH端、Mg2+ 活性：从3’ OH端降解dsDNA 动态平衡：过量dNTPs 无dNTP时： 外切 占主导 足够dNTP ：