细胞培养基本方法(复苏、换液、传代、冻存).docx

/?， 二传代培养 ■准备及注意事项 ■换液□ I传代□ I冻存 I复苏 I MTT 4 4 准备事项 紫外灯照射细胞室30分钟，风机运行10分 钟后方可进入实验室. 穿专用的口罩，帽子，拖鞋，工作衣等. 带手套，并用酒精擦拭之， 准备好实验必需用品. 超净工作台内操作前用酒精棉球擦拭台面. 超净工作台内操作完成后， ■要用酒精棉球擦拭台面，除了酒精灯，綴子，试管架 等物品外，其他都要拿出工作台外. ■紫外灯照射30分钟. 换液 把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子; 观察瓶内培养基的颜色,是否浑浊等； 放在倒置显微镜下观察细胞生长状况。 放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶 口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒. 取下盖子，烧瓶口;倒掉培养基,烧瓶口 ； 拿出PBS液瓶子，烧瓶口和樣子;用儀子将 塞子取出,烧瓶口（至少10圈）。 6?用吸管吸取3ml的PBS,打入培养瓶内。烧培养瓶口, 来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此操作一次。 7.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镶子；用镶子将塞子取出, 烧瓶口（至少10圈）。 8?用吸管吸取5ml?8ml的培养基打入培养瓶内，烧瓶口, 镶子和盖子； 9.盖上盖子，倒置显微镜下观察，之后标明名称和日期, 酒精棉球擦瓶口和瓶身，放入培养箱内即可。 注意： 1 .打开培养箱时尽量不要说话； 2.步骤9中培养瓶放入培养箱时，应把盖子拧开少许。 传代 把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子; 观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在 倒置显微镜下观察细胞生长状况。 放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶 口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。 取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口； 拿出PBS瓶子，烧瓶口和镣子；用镶子将塞 子取出，烧瓶口（至少10圈）。 用吸管吸取3ml的PBS,打入培养瓶内。烧培养 瓶口，来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此 操作一次° 拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镶子；用镶子将塞子取 出，烧瓶口（至少10圈）o 用吸管吸取1 ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养 瓶口和盖子，盖上盖子； 拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5分钟 后取出； 4 4 PAGE PAGE # 在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若 细胞变成单个圆形，则可进行传代。 拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶 口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。 拿出培养基瓶子，烧瓶口和镶子；用镶子 将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。 用吸管吸取5ml的培养基打入培养瓶内， 用吸管吹打成单个细胞悬液。计数，分装 即可。 冻存 1 .把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子； 观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在 倒置显微镜下观察细胞生长状况。 放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶 口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。 取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口； 拿出PBS瓶子，烧瓶口和镶子；用镶子将 塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。 6.7.9.用吸管吸取3ml的PBS,打入培养瓶内。烧培养 瓶口，来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此 操作一次。 6. 7. 9. 拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镶子；用镶子将塞子 取出，烧瓶口（至少10圈）o 8.用吸管吸取1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养 瓶口和盖子，盖上盖子； 8. 拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然 后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5 芬钟后取由； 10.在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若细胞 变成单个圆形，则可进行传代。 11 .拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶 口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。 拿出培养基瓶子，烧瓶口和镣子；用镶子 将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）o 用吸管吸取5ml的培养基打入培养瓶内，用吸管 吹打成单个细胞悬液。 用吸管将细胞悬液移至5ml离心管中，盖上盖 子，在离心机内离心，1500转/分钟，时间为15 分钟。 离心结束后，拿至工作台内，烧离心管口。去掉 塞子，烧管口。 4 4 PAGE PAGE # 弃上清液，加冻存液2ml吹打，使细胞均匀混在 冻存液中，再加3ml冻存液，用吸管吸出打入多 个冻存管中，每管1.5mL 盖上盖子，用封口膜封好，标上细胞名称和日期. 冻存方式：4C30分钟，?2(TC15分钟，?8(TC60 分钟，最后转移到液氮罐内。 注意： 冻存管移动时要夹在冰块中间O 复苏 L取一敞口瓶，内装蒸馅水，放入电热恒温 水槽中，温度设置为39.0°Co 2等达到39OC30分钟后，用镶子将欲复苏 的细胞从液氮管中取出，快速放入敞口瓶 内，晃动，使冻存管内完全液化。 3■用酒精擦拭冻存管，放入工作台内。 用镶子将封口膜夹掉，轻烧管口; 5■用吸管吸出冻存管内的细