黄精多糖对衰老小鼠肝线粒体呼吸链酶及DNA聚合酶γ表达的影响临床医学.docVIP

黄精多糖对衰老小鼠肝线粒体呼吸链酶及DNA聚合酶γ表达的影响临床医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：黄精多糖对衰老小鼠肝线粒体呼吸链酶及DNA聚合酶γ表达的影响临床医学 1 1 资料与方法 2 2 结 果 4 3 讨 论 5 文2：细胞信号转导DNA聚合酶与体细胞基因突变医学 5 一、基因突变并非全直接由DNA损伤触发 5 四、DNA损伤剂诱发细胞信号转录途径的激活 7 参考文摘引言： 8 原创性声明（模板） 9 文章致谢（模板） 10 正文 黄精多糖对衰老小鼠肝线粒体呼吸链酶及DNA聚合酶γ表达的影响临床医学 文1：黄精多糖对衰老小鼠肝线粒体呼吸链酶及DNA聚合酶γ表达的影响临床医学 许多研究证明，线粒体DNA(mtDNA)损伤呈增龄性积累，且与生物衰老之间存在高度的相关性〔1，2〕。线粒体氧化损伤程度受到线粒体抗氧化系统及修复系统的监控，其中碱基切除修复在监控线粒体DNA氧化损伤中起主要作用〔3〕。黄精多糖有抗衰老、抗肿瘤、抗炎、降低血脂血糖、增加机体免疫力等一系列作用。本实验观察黄精多糖对衰老小鼠肝线粒体呼吸链酶和DNA损伤和改善线粒体能量代谢方面提供部分理论依据。 1 资料与方法 药品和制剂 黄精多糖购于佳木斯医学院药店，经提取纯化并干燥。D半乳糖(Dgal)(上海试剂二厂);RTPCR试剂盒(大连宝生物公司) 。 动物 昆明小鼠，2～3月龄，雌雄各半，由佳木斯大学实验动物中心提供。随机分成青年对照组、衰老模型组、衰老模型黄精多糖大剂量组、中剂量组、小剂量组，每组18只。 方法 衰老模型组及各给药组，每日上午颈背部皮下注射Dgal 100 mg/kg，青年对照组注射等量的生理盐水，连续4 w，造模完成后，第29天开始，模型给药组分别给予黄精多糖400、200、100 mg/kg予以灌胃，青年组、衰老组灌服等量的温开水，连续4 w。第56天末次给药前禁食12 h，给药1 h后颈椎脱臼处死，打开腹腔迅速取肝组织。 样品制备 制备10%肝组织匀浆 取肝脏 g左右，在冷生理盐水中漂洗，滤纸拭干称重，加入9倍体积预冷的匀浆介质，用电动匀浆机充分磨碎得组织匀浆。 制备线粒体 取10%的肝组织匀浆，以2 000 min离心10 min，弃沉淀，取上清液以10 000 min高速冷冻离心机离心15 min，沉淀物即为线粒体，将分离的线粒体悬浮于冰冷的匀浆介质中制备成混悬液，反复冻融使线粒体膜破裂，备用。 肝脏总RNA提取 取出的肝组织，用DEPC处理过的生理盐水清洗，锡纸包好，放入液氮中冻存。在液氮中研磨50～100 mg放入1 ml Trizol内剧烈震荡，静置5 min，加氯仿200 μl，震荡15 s，4℃ 静置～ min，12 000 min离心15 min，取上清液置于EP管中，加异丙醇500 μl，4℃ 静置10 min，12 000 min离心10 min，弃上清，用75%的乙醇1 ml洗沉淀，4℃离心7 500 min 5 min，弃上清， 自然 干燥。制成RNA溶液以分光光度法进行定量，测光密度A260/A280比值。采用甲醛变性电泳检测RNA完整性。 PCR引物〔4〕 DNA聚合酶γ上游5′TCAAGGAAGTCACGATGG3′;下游5′AGGCACTGGTCAATGTCTAC3′，预计扩增片段470 bp。GAPDH上游5′GGAGTTGCTGTTGAAGTCG3′;下游5′GTGCTGAGTATGTCGTGGAG3′，预计扩增片段599 bp。 RTPCR 参照TaKaRa RNA LA PCRTM Kit(AMV) Ver 介绍的方法。混匀后置于30℃ 10 min，50℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min合成cDNA。PCR反应体系反应条件94℃ 5 min，94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环。 电泳与凝胶成像 取4 μl PCR扩增产物、2 μl上样缓冲液在%琼脂糖凝胶水平电泳上做产物检测分析，电压80 V，电泳 h，EB 染色，经YLN2000凝胶成像分析系统照相分析，用DNA聚合酶γ mRNA产物的OD值与GAPDH mRNA 产物的OD值作为DNA聚合酶γ产物的相对含量。 线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ的测定〔5〕 在样品杯中加入 mol/L，的磷酸缓冲液 ml，10 mol/L铁氰化钾 ml，线粒体悬浮液 ml， mol/L氰化钾 ml，用双蒸水补充体积至 ml，加入 mol/L NADH 30 μl作为启动剂，在420 nm波长处进行检测。空白杯中用同体积分离介质代替线粒体悬浮液，不加NADH，其余加入试剂均同样品