杞菊地黄口服液中马钱苷含量测定的方法学验证方案.pdfVIP

杞菊地黄口服液中马钱苷含量测定的方法学验证方案 一、设计背景 杞菊地黄口服液是由枸杞子、菊花、熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻 制成的复方制剂，具有滋肾养肝功效，常用于治疗肝肾阴虚引起的眩晕耳鸣、视物昏花 等。目前报道测定杞菊地黄口服液的含量的方法有薄层扫描法、紫外吸收光谱法及高效 液相色谱法等。含测指标主要有丹皮酚、熊果酸、芍药苷、马钱苷、绿原酸等。酒萸肉 有涩精、敛汗、补肝肾的功效，是杞菊地黄口服液的臣药，马钱苷是一种环烯醚萜类糖 苷，是酒萸肉的主要有效成分之一，常通过检测马钱苷的含量来衡量酒萸肉的投料和质 量。 二、设计依据 高效液相色谱法是含量测定的常用方法，尤其适用于复杂成分的定量分析，具有分离 效能高、速度快、高灵敏度、高选择性等优点。杞菊地黄口服液是一种常用的中成药，由 八味药材提取制成，成分非常复杂，因此，选择含量测定的首选方法高效液相色谱法测定 马钱苷的含量较合适。本方案以《中国药典》（2020 版）四部通则分析方法验证指导原则 为依据，结合生产企业实际情况，设计杞菊地黄口服液马钱苷的含量测定方法学验证方 案，主要考察专属性、线性关系、精密度、稳定性、重复性、回收率、耐受性实验等内容。 三、设计方案 （一）仪器与材料 1.仪器 水浴锅、电子天平、超声仪、高效液相色谱仪（岛津）等。 2.材料 马钱苷对照品（中国食品药品检定研究院购买），杞菊地黄口服液，色谱纯甲醇、 色谱纯乙腈，超纯水，四氢呋喃、正丁醇为分析纯。 （二）测定方法 1.流动相的选择 根据文献的报道，尝试四氢呋喃- 乙腈- 甲醇溶液、乙腈-水、甲醇- 乙腈-水及不同的 配比作为流动相，梯度洗脱。经实验确定流动相的优劣，记录出峰的保留时间和峰形， 确保马钱苷与相邻峰可以完全分离，以此为标准确定最终的流动相组成。 2.检测波长的选择 取马钱苷对照品溶液在紫外可见分光光度计上190nm~400nm 范围内扫描，得到光谱 图，找出最大吸收波长（文献报道为240nm ），以实际最大吸收波长作为测量波长。 3.对照品溶液的配制 精密称取 10mg 马钱苷对照品，放入25ml 容量瓶中，加甲醇适量先初步混匀，再加 甲醇定容至刻度，摇匀。再精密移取1ml 该溶液，转移至25ml 容量瓶中，再次定容，摇 匀。 4.供试品溶液的配制 精密移取杞菊地黄口服液5ml，采用正丁醇提取蒸干，残渣加少量甲醇溶解，倒入25ml 容量瓶中，用甲醇少量多次洗涤蒸发皿，加甲醇定容制刻度，摇匀。再精密移取1ml 该溶 液，转移至25ml 容量瓶中，再次定容，摇匀。 5. 自制杞菊地黄口服液 称取枸杞子、菊花各33 克，熟地黄130 克，山茱萸、山药各65 克，牡丹皮、茯 苓、泽泻各50 克以上药品，择净晾干，加水煎煮3 次，过滤。3 液合并放冷，搅匀，灌 装，密封，消毒，即得。 6.阴性供试品溶液的配制 取缺山茱萸的其他药材，按自制杞菊地黄口服液工艺及供试品溶液的制备方法制成 缺山茱萸的阴性供试品溶液。 7.阴性干扰实验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，注入高效液相色谱仪测定，结果 应使马钱苷相应保留时间处无干扰。 8. 色谱条件的确定与专属性实验 色谱柱：ZORBAX C18 柱温：25 ℃ 进样室温度：室温 进样体积：20 μl 记录马钱苷的保留时间和峰形，计算分离度，判定是否可以达到良好的分离效果。 结果记录： 物质名称 保留时间（min ） 马钱苷 （三）方法学验证 1.线性关系 分别精密称取马钱苷的对照品溶液0.5 ，0.25 ，0.1 ，0.05，0.025ml ，用稀释液定容至 10ml 的容量瓶之中，取适量摇匀，微孔滤膜过滤，分别进样1 微升，以对照品溶液的浓 度（mg/ml ）为横坐标，以对照品峰面积为纵坐标，绘制马钱苷的标准曲线，记录马钱苷 的回归方程、相关系数、和线性范围。 结果记录： 序号 1 2 3 4 5 6 浓度 峰面