RMT1-10体外诱导耐受性树突状细胞对小鼠高危角膜移植排斥反应的抑制作用及其机制.docxVIP

? ? RMT1-10体外诱导耐受性树突状细胞对小鼠高危角膜移植排斥反应的抑制作用及其机制 ? ? 赵敏 杨柳清 王梦宇 陶钰 郭永越 苏锐锋 石晶 谭小波 1承德医学院附属医院眼科，承德 067000；2承德市中心医院眼科，承德 067000 角膜移植是治疗角膜盲的有效方式，但高危角膜移植的排斥反应发生率超过70%，寻找诱导受体产生对供体的抗原特异性免疫耐受策略对防治角膜移植排斥反应具有重大意义[1]。近年来，T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域分子1(T cell immunoglobulin and mucin domain containing molecule-1，Tim-1)在角膜移植排斥反应中的作用受到研究者的关注。马明等[2]研究证实Tim-1表达在活化的T细胞表面，通过提高正性共刺激信号促进T细胞活化增生以及相应细胞因子产生，最终促进角膜移植排斥反应发生。本课题组前期研究发现，Tim-1的阻断抗体RMT1-10可以诱导受体形成免疫耐受并抑制角膜移植排斥反应发生，但其作用机制尚未完全明确[3]。研究发现，如果在致敏阶段未成熟树突状细胞(immature dendritic cells，imDCs)暴露于抗原时抑制其表达主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)或共刺激分子可以使其转化为耐受性树突状细胞(tolerogenic dendritic cells，Tol-DCs)，而Tol-DCs可以在免疫反应过程中保持其未成熟表型并通过减少抗原提呈、降低促炎细胞因子、增加调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)等机制诱导形成免疫耐受，因此Tol-DCs也被认为是抑制角膜移植排斥反应的有力工具[4-7]。作为共刺激分子家族的重要一员，Tim-1不仅分布于活化的CD4+T细胞表面，也分布于DCs表面，推测RMT1-10阻断Tim-1信号可能促使imDCs转化为Tol-DCs，诱导免疫耐受并抑制角膜移植排斥反应。本研究拟探讨RMT1-10体外诱导的Tol-DCs对小鼠高危角膜移植排斥反应的抑制作用及其机制。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1实验动物 SPF级雄性BALB/c小鼠100只和C57BL/6小鼠50只，体质量18～22 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物的饲养和使用符合国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。本研究方案经承德医学院附属医院伦理委员会审核批准(批文号：CYFYLL2020055)。 1.1.2主要试剂及仪器 重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(recombinant mouse granulocyte-macrophage colony stimulating factor，rmGM-CSF)、重组小鼠白细胞介素4(recombinant mouse interleukin-4，rmIL-4)、FITC标记的抗鼠CD11c抗体、PE标记的抗鼠MHC-Ⅱ、CD80、CD86、Tim-4、CD103抗体(美国eBioscience公司)；脂多糖、Tris-NH4Cl(美国Sigma公司)；RPMI1640培养液、胎牛血清(美国Gibco公司)；抗鼠Fc封闭性抗体(美国eBioscience公司)；细胞计数试剂盒(cell counting kit，CCK)-8(美国Sigma-Aldrich公司)；IL-10、转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒(美国Biosource公司)；RMT1-10及其IgG同型对照抗体(美国Bio X Cell公司)。Multiskan FC酶标仪(美国Termo Fisher Scientific公司)；FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)；Mitsutovo螺旋测微器(日本三丰公司)。 1.2 方法 1.2.1DCs的获取及分组处理 颈椎脱臼法处死C57BL/6小鼠，无菌取股骨，冲洗骨髓细胞，Tris-NH4Cl裂解红细胞5 min，以1×l06个细胞/孔接种于6孔板，每孔添加10 ng/ml rmGM-CSF和1 ng/ml rmIL-4，培养3 d后，吸弃培养基及悬浮细胞，重新加入RPMI1640完全培养基及rmGM-CSF、rmIL-4，继续培养3 d，收集疏松贴壁细胞即为imDCs。将获取的imDCs按照诱导干预措施的不同分为imDCs组、mDCs组、RMT1-10组和IgG同型对照组，其中imDCs组不做干预，继续培养24 h；mDCs组在培养第6天加入终质量浓度为10 mg/L脂多糖