利用荧光标记ssr构建百合种质资源分子身份证.docxVIP

利用荧光标记ssr构建百合种质资源分子身份证 李立伟，中国约47个品种和变种（龙亚宜，张金正，1998）。近50年来已培育的百合品种达9 400个 (International Lily Register, /) 。随着育成品种数量的不断增长以及种质交流的日趋频繁, 准确地鉴别百合品种非常重要。 用于种质鉴定的分子标记技术主要包括ISSR、RAPD、SRAP、SSR和SNP等, 其中SSR (simple sequence repeats) 分析技术更具有在染色体上分布均匀、多态性丰富、共显性、分辨率高和易于检测等优点 (MorganteOlivieri, 1993) 。Dangl等 (2009) 采用12对SSR引物构建了18份加利福尼亚扁桃种质的指纹图谱。Oliveira等 (2010) 采用48对SSR引物构建了32份大豆种质的指纹图谱。Pan (2010) 利用21对SSR引物构建了1 025份甘蔗种质的分子身份证库;Moriya等 (2011) 利用15对引物构建了95份苹果种质的指纹图谱。杨阳等 (2010) 利用17对SSR引物构建了湖南省36份茶树品种 (系) 的分子指纹图谱;王黎明等 (2011) 利用103对SSR引物构建了142份甜高粱品种的分子身份证。由于分子身份证是指纹图谱数字化后得到的字符串, 其构建实现了品种比对的自动化, 具有高效、准确和方便的优点, 更适合进行大规模的品种比对。 目前常用的SSR-PCR分析是利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物, 但该方法的缺点是不能准确读出目标DNA片段的大小, 检测效率偏低和难以对大规模不同批次品种DNA指纹鉴定数据进行有效整合 (程本义等, 2011) 。与常规的凝胶电泳检测法相比, 基于DNA测序仪的SSR荧光标记毛细管电泳检测方法可以得到目标DNA片段的准确大小, 检测结果更为精确, 适用于大批量样品的检测分析。SSR荧光标记毛细电泳检测技术已成功应用于小麦 (Fujita et al., 2009) 、无花果 (Achtak et al., 2009) 、甘蔗 (Pan, 2010) 、大豆 (Oliveira et al., 2010) 、苹果 (Moriya et al., 2011) 、水稻 (程本义等, 2011) 、枣 (麻丽颖等, 2012) 和梨 (高源等, 2012) 等的品种鉴定研究中。 近年来在百合中也开发了一批稳定性好的SSR标记, 并已应用于系统进化和遗传多样性等研究中。杨素丽等 (2008) 和Lee等 (2011) 先后利用NCBI上的百合EST序列开发了一批SSR引物;葛亮等 (2012) 利用19对SSR核心引物对部分百合资源进行了遗传系统进化分析;Kawase等 (2010) 和Sakazono等 (2013) 利用双重抑制PCR技术开发了一批SSR引物;Yuan等 (2013) 利用岷江百合 (L.regale) 转录组数据开发了494对SSR引物。这些工作为利用SSR引物构建百合的分子身份证奠定了良好基础, 但至今尚未见相关研究报道。 本试验中利用筛选到的SSR引物, 采用荧光测序技术结合新的带型编码方式构建96份百合样本的分子身份证, 并探索高精度、高通量和高效率构建百合分子身份证的技术体系, 以期为品种鉴定和亲缘关系分析等相关研究提供参考。 1 材料和方法 1.1 蔬菜花物学 试验于2010年10月至2012年6月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所进行。试验材料共96份, 其中包括22个原生种, 74个杂交品种。 1.2 ssr引物合成及优化 选取新鲜的百合幼叶, 用改良CTAB法 (Beek et al., 1992) 提取各样品材料的总DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度计检测DNA质量和浓度, 并将其浓度稀释至50 ng·μL 从Yuan等 (2013) 报道的172对EST-SSR引物中筛选出扩增条带清晰、稳定、多态性高的20对引物 (表1) 用于样品的扩增。合成20对荧光标记引物, 每4对标记为一组, 共分5组, 每组4对引物的正向引物上分别加注的荧光染料为6-FAM (蓝) 、HEX (黄) 、TAMRA (黑色) 和ROX (红) 荧光基团 (表1) , 由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成。 SSR-PCR反应体系参照葛亮等 (2012) 的体系进行。采用温度梯度PCR (Gradient PCR) 对引物退火温度进行优化, 得到各对引物合适的退火温度 (表1) 。PCR循环条件是:94℃预变性5 min;94℃变性30 s, 合适退火温度退火30 s, 72℃延伸45 s, 35个循环;72℃延伸7 min。反应在Bio-Rad PTC-200上进行。 1.3 荧光标记产物片段大小测