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越橘反转录转座子插入术的分子身份证构建 随着中国蓝莓的种植面积的不断扩大，优良新品种的产量也不断增加。一些新品种已从美国、加拿大、澳大利亚和新西兰等国家进口（崔建民等，2010；尹德杰，2012；崔耀宇等，2014）。然而在引种时存在音译名、意译名以及自拟商品名等多种命名方式;推广过程中品种不真实、种苗混杂等问题也越来越突出, 严重影响了越橘产业的健康发展, 同时给越橘育种工作造成了极大困扰 (郭照东等, 2015) 。因此, 亟需建立快速、准确的越橘品种鉴别方法。 以DNA序列差异为基础的分子标记技术为越橘品种的快速鉴别提供了线索。一些学者利用RAPD分子标记建立了少数越橘品种的鉴定体系 (Aruna et al., 1993;Arce-Johnson et al., 2002;Giongo et al., 2004) , 随着需要鉴定品种数量的增加, RAPD标记所能提供的信息量不能满足分析的需求。此外, 基于RAPD和ISSR标记对越橘品种的鉴定和亲缘关系分析不能很好地反映越橘品种间的谱系数据, 这与RAPD和ISSR技术的局限性或者越橘品种的遗传背景有关, 需要通过其他类型的分子标记来进一步验证 (LeviRowland, 1997;於虹等, 2009) 。郭照东等 (2015) 利用SSR分子标记对22个越橘品种进行了鉴别, 但由于SSR标记自身存在无效等位基因、SSR区域滑移错配、短等位基因显性等问题 (Pompanon et al., 2005) , 可能会对鉴定结果产生影响。因此有必要开发新的分子标记并验证其在越橘品种鉴别中的有效性。 反转录转座子是广泛分布于高等植物基因组中的一类转座元件, 它先转录形成RNA, 再以RNA为媒介通过反转录酶反转录成DNA插入到基因组靶基因位置 (Havecker et al., 2004;蒋爽等, 2013) 。与RAPD、ISSR和SSR等传统分子标记相比, 基于反转录转座子插入多态性 (Retrotransposon-based insertion polymorphisms, RBIP) 的标记具有在基因组中分布更加广泛, 高度异质性和多态性丰富等特点 (Flavell et al., 1992;柯玲俊等, 2017;王庆竹等, 2018) 。适用于越橘品种的反转录转座子分子标记尚未建立, 基于此类标记的越橘品种亲缘关系研究亦未见报道。作为同属的近缘种, 蔓越橘 (V.macrocarpon‘Ben Lear’) 基因组已经测序完成, 反转录转座子占其全基因组序列的10.14% (Polashock et al., 2014) , 如此丰富的反转录转座子为越橘相关分子标记的开发及其在品种鉴定中的应用提供了机遇。 本研究中从蔓越橘基因组中发掘了长末端重复反转录转座子 (Long Terminal Repeat Retrotransposons, LTR-RT) 序列, 基于LTR-RT插入多态性开发了适用于越橘品种的RBIP分子标记, 并对越橘和蔓越橘共46个品种进行了亲缘关系分析和分子身份证构建, 旨在为越橘育种亲本选择和品种快速准确鉴别提供参考。 1 材料和方法 1.1 dna提取和检测 2017年3月从浙江师范大学越橘品种资源圃随机选取树体长势良好的越橘品种45个和蔓越橘品种1个 (表1) , 每个品种取健康幼嫩叶片用于DNA提取。采用改良CTAB法提取基因组DNA (Doyle, 1987) , 使用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量, 使用微量分光光度计Nano Drop 2000 (Thermo Fisher Scientific, US) 测定DNA浓度。将DNA原液稀释到20~30 ng·μL 1.2 认知行为训练和脑梗死超基因实验 蔓越橘基因组序列 (Bio Project number:PRJNA245813) 获取自美国国家生物技术信息中心 (National Center of Biotechnology Information, NCBI) 。典型的LTR-RT结构特点 (图1) 为: (1) 序列两端各有一段高度相似的长末端重复序列 (Long Terminal Repeat, LTR) , 分别为5′-LTR和3′-LTR, 两段序列5′端以TG开始, 3′端以CA结尾, 一般序列长度≥200 bp; (2) 两段LTR序列之间是gag功能域和AP、INT、RT、RH等4种酶; (3) 在5′-LTR末端含有约18 bp的引物结合位点 (Primer Binding Site, PBS) ; (4) 在3′-LTR的起始位置含有多嘌呤序列 (Polypurine Tract, PPT) 。使用LTRharvest (Ellinghaus