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亚麻种质资源的rapd引物筛选 0 dna指纹图谱 郑和是天麻科的一种一级植物。它是世界上最古老的纤维植物之一，被称为“纤维女王”。目前中国现有的亚麻种质资源3000多份,很多栽培品种从种子和植株形状上很难区分开,亚麻种质资源是亚麻育种和生产发展的重要物质基础,因此迫切地需要找到一种快速、准确的鉴定亚麻种质的有效方法。DNA指纹图谱是一种能够鉴别生物个体之间差异的DNA电泳图谱,可直接反映生物的遗传物质在DNA分子水平上的差异。它是建立在DNA分子标记基础之上的,多态性丰富,与传统的形态学方法相比,具有高度的个体特异性、环境稳定性,还有快速、准确等优点,是鉴定种质资源、品种、品系的有力工具 RAPD标记技术已广泛应用到各种生物的研究中,在检测物种的多样性、生物分类、构建基因图谱、进行基因定位以及构建遗传连锁图等研究中得到应用。陈一华等 目前亚麻种植资源的开发鉴定和评价研究还没有得到很好的完善,利用分子标记对亚麻进行遗传分析,探讨其在亚麻种质资源鉴定研究中的可靠性及适用性,并筛选出可以鉴别品种的特异引物,探索有效鉴别亚麻品种的标记和方法,对亚麻种质资源的分类研究及亚麻品种的鉴定都具有重要意义。本研究利用1480条RAPD标记对来源于世界不同国家和地区的26份亚麻品种及种质资源进行引物筛选、多态性分析,并初步建立了亚麻RAPD标记分子身份证体系,为亚麻种质资源的保存、鉴定、研究和利用提供理论依据,也为品种鉴定、遗传育种、遗传工程利用提供有益参考。 1 材料和方法 1.1 试验材料 26份材料的名称、来源见表1。所选的26个品种是来自不同国家。 1.2 方法 1.2.1 亚麻基因组dna的提取 取亚麻幼苗适量,采用OMEGA植物DNA提取试剂盒提取亚麻基因组DNA。用0.8%琼脂糖电泳检测DNA的完整性和纯度,并用紫外分光光度仪检测。将DNA浓度稀释为25 ng/μL,-20℃冰箱中保存、备用。 1.2.2 生物公司的纺粘设备 实验所用的1480条RAPD随机引物购自上海生工和英俊生物公司。RAPD反应体系20μL:25 ng/μL模板DNA 1μL,10μmol/L引物2μL,10μmol/L d NTP 0.5μL,10×PCR缓冲液(含Mg 1.2.3 脂糖凝胶电泳 RAPD标记的PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析,1×TBE电泳缓冲液,电压80 V,电泳100 min,EB染色15 min,紫外透射仪照相。 1.3 建立数据组合矩阵 根据PCR扩增结果,对清晰可见的条带全部采用人工读带的方式统计分析,不稳定的条带或弱带不进行统计,在相同的迁移率位置上,某一扩增条带出现时赋值为1,无带赋值为0;建立原始的0-1的数字矩阵。将100 bp梯度间距以大致5 bp分为最小识别单位,估计扩增片段的大小。 据RAPD分子标记的数据统计结果,采用统计分析软件NTSYS-2.10对26份材料的遗传相似性进行分析,以共有片段比例为指标计算材料之间的遗传相似性系数,根据遗传相似性系数,通过NTSYS2.10用非加权类平均法(unweighted pair group of arithmetie menas,UPGMA)进行聚类分析,并绘制成树状图。 2 结果与分析 2.12 份亚麻材料间的扩增 利用26个亚麻材料的混合DNA对1480条RAPD随机引物进行初步筛选,得到条带数多、条带较清晰的引物334个,再用这334个引物对26份亚麻材料进行扩增,筛选出了多态性好、条带清晰的引物32个(表2)。32个引物共扩增出稳定、清晰的185条带,条段数在3~11之间,平均每个引物扩增出5.7条带,其中差异条带有79条,多态性比率为44.4%。引物S1270(图1)和S1238扩增条带数最多,分别为11条和9条。多态性最好的引物是ST09(图2),6条带有5条为多态性带,多态性比率达83.3%。 2.22 个亚麻品种的亲缘关系 利用32个RAPD引物对26份亚麻材料进行聚类分析,从聚类树状图(图3)可以看出,其遗传相似性系数变异范围在0.51~0.97之间。其中AGATHA与中亚麻1号的遗传相似性系数最大为0.963,表明这两个品种的亲缘关系较近。而在这些亚麻品种中遗传相似性系数最小的为派克斯与Alfonso INTA,为0.512,则表明它们之间的亲缘关系较远。在聚类树状图中,当遗传相似性系数约为0.67时,这26个亚麻品种可分为3个类群:第Ⅰ类群包括两个品种,分别是Line No.7和Alfonso INTA。第Ⅱ类群也包括两个品种,分别Y7I118和Y7I117。其余的22个品种为第Ⅲ类群,在第Ⅲ类群中,ленок与其余的21个品种的遗传相似性系数较小,表明在这个类群中ленок与其他的品种亲缘关系较远。RAPD标记聚类分析的结果在多数品种中反