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一种溶菌酶样蛋白的功能研究 肺炎魁（s.pn）是一种常见的革兰阳性疾病，可导致严重的革兰氏阳性疾病，如肺炎、中耳炎、细菌血虚病和脑炎。世界上有很大的发病率和死亡率。 本课题组前期利用体内表达技术 (in vivo expression technology, IVET) , 在体内筛选鉴定出肺炎链球菌的15个体内诱导基因 本研究通过替代失活的方式构建该基因的缺失菌株, 比较其与野生菌株的增值能力、细菌形态、荚膜合成及感染小鼠的能力等方面的变化, 鉴定该基因的功能。并通过构建带有拯救质粒的基因缺失菌株, 排除由于基因敲出后可能会通过染色体邻近效应或极性效应对周边基因表达的影响, 从而确证其功能 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 菌株和质粒 肺炎链球菌D39菌株购自英国国家典型菌种保藏中心 (National Collection of Type Culture, NCTC) , 肺炎链球菌CPM8菌株 (含有红霉素抗性基因) 由美国加州大学Morrison教授惠赠, 大肠杆菌 (Escherichia coli) DH5α菌株 (本室保存) , PMV158穿梭质粒由Manuel Espinosa教授 (Biological Research Center Ramiro de Maeztu, Spain) 惠赠。 1.1.2 试剂与试剂盒 Primer star高保真酶, BglⅡ, salⅠ限制性内切酶, DNA maker, Real Time PCR试剂盒, DNA纯化试剂盒, RNA逆转录试剂盒, 购自TaKaRa公司;RNA提取试剂盒购自OMEGA公司;T4连接酶购自Promega公司;细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技 (北京) 有限公司;胶回收试剂盒购自Invitrogen公司;抗荚膜多糖抗体购自Statens Serum Institut (丹麦) , 其他试剂均为国产或进口分析纯。 1.1.3 引用 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成 (表1) 。 1.2 菌株扩增和al-4-诊断 利用长臂同源PCR技术构建spd0873基因缺失菌, 首先以肺炎链球菌D39菌株基因组DNA为模板, 用P1、P3引物扩出0873上游基因, P2、P4引物扩0873下游基因, 然后以肺炎链球菌CMP8菌基因组为模板, 用DAM212、DAM213引物扩红霉素基因 (erm) , 然后将这三部分基因按等摩尔比例混合, 用P1、P4引物, 扩增出spd0873up-erm-spd0873down连接产物。将连接产物转化到肺炎链球菌D39菌, 铺于含0.25μg/mL红霉素血平板上, 挑出阳性转化子, 经PCR及测序鉴定, 正确即为D39△0873缺失菌 (D39△0873) 。 1.3 重组质粒的筛选 以肺炎链球菌D39菌株基因组DNA为模板, 用引物0873F1、0873R1PCR扩增目的基因, 经Sal I+Bgl II双酶切后插入具有相同酶切接头的PMV158穿梭质粒中, 重组质粒命名为PMV158+0873, 然后转入DH5α菌中, 用含16μg/mL四环素的LB平板对阳性克隆进行筛选, 对筛选出的阳性克隆进行菌液PCR, 双酶切及测序鉴定。将连接正确的PMV158+0873质粒转化到D39△0873缺失菌中, 铺于1μg/mL四环素的血平板上, 挑出阳性转化子, 经PCR及测序鉴定正确后, 即为带有拯救质粒的缺失菌株 (D39△0873+0873) 。 1.4 d9、3g983及3g9833+新型菌株 在含2%麦芽糖的C+Y培养基分别培养D39、D39△0873及D39△0873+0873菌, 调节起始OD值一致, 每隔1h测量一次吸光度值OD 1.5 大鼠毒力实验 将肺炎链球菌D39、D39△0873及D39△0873+0873菌株在C+Y培养基中培养至OD 1.6 pcr检测200873基因的表达 在含2%麦芽糖的C+Y培养基分别培养肺炎链球菌D39、D39△0873及D39△0873+0873菌株至OD 1.7 荚膜多糖变化观察 收集10 mL对数生长中期肺炎链球菌, 以转速2400×g离心10 min, 弃去上清, 加入1 mL戊二醛固定, 送电镜室制片, 用透射电子显微镜Hitachi-7500 (日立公司) 观察荚膜多糖改变, 放大倍数10万倍。 1.8 细菌培养和转染 培养肺炎链球菌D39、D39△0873及D39△0873+0873菌株, 10000×g收集细菌, 用PBS洗涤细菌3次, 用抗原包被液调节OD 2 结果 2.1 缺失菌株的扩增和测序 D39野生菌株在转化了连接片段后, 通过同源重组, erm基因替代染色体上的spd-0873基因, 因此在PCR鉴定中, 缺失菌株可以78