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蛹虫草不同菌株生物学特性及栽培试验 蠕虫虱子。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 试验中的蘑菇 1.1.2 培养基 (1) PDA加富培养基:马铃薯200 g, 葡萄糖20 g, 蛋白胨3 g, KH 1.2 方法 1.2.1 种子平板的制备 将野生虫草子座用清水洗去表面浮土, 置于75%乙醇中表面消毒2min, 在无菌水中反复冲洗, 放在无菌培养皿内备用。用无菌解剖刀将消毒后的虫草子座切成长度约1cm的小段, 接种于PDA培养基的平板上。将接种后的平板放置在22~25℃的培养室中培养。平板略微倾斜放置。48~72h后菌丝萌发, 选择无污染的菌丝, 转接到新的PDA平板上进一步分离, 最终得到纯化的虫草菌株。 1.2.2 社会学观察 1.2.3 培养基培养处理工艺 将5个供试菌种分别接种于PDA培养基斜面上, 22~25℃培养7~10d, 待菌丝长满斜面。将活化后的斜面母种接入含有50m L液体培养基的三角瓶中, 22~25℃震荡培养3~4d, 菌丝长满液体表面。静置24h确保无杂菌后, 转入500m L营养液中。将30g小麦和50m L自来水装入罐头瓶后用耐高温塑料膜扎紧, 100℃常压灭菌8h, 过夜冷却。取5m L液体菌种, 以无菌操作接入瓶内小麦培养基上, 18℃黑暗条件下培养7d。此阶段主要注意避光和低温。待菌丝长满培养基后, 22℃光照转色。转色7d后在塑料膜上打孔 1.2.4 对分子的鉴定和系统发育的研究 1.2.4. 不同温度下ctab缓冲液的稳定性测定 采用CTAB法取适量子实体样品置于研钵中, 液氮冷冻研磨至粉末状。将样品粉末转移到含4 m L CTAB缓冲液的灭菌离心管中, 65℃下温育40min, 每隔10min颠倒几次, 使样品混匀。在通风橱内, 加入4 m L氯仿∶异戊醇 (24∶1) , 轻微震荡混合20 min。4℃离心10000 r·min 1.2.4. pcr反应u2004 50μL PCR扩增反应体系为:模板DNA 1μL、10×PCR buffer 5μL、Taq DNA聚合酶0.8μL、d NTP (2.5m M) 4μL、ITS4、ITS5 (20μM) 引物各1μL, 用去离子水补至50μL。反应程序为:95℃预变性5 min后, 进入循环, 94℃变性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸1 min, 共40个循环, 于72℃延伸10 min。 PCR产物用1%琼脂糖凝胶, 1×TAE为电泳缓冲液, 5V·cm 1.2.4. 系统发育树的构建 将所扩增出的5个供试菌株的ITS序列提交到Gen Bank核酸序列数据库, 与Genbank中已经登录的序列进行Blastn比对, 下载Score分值高的9株最相似菌株的ITS序列与供试菌株的序列进行系统发育树的构建。用Clustal X软件处理分析5个供试菌株的ITS序列, 再用DNASTAR软件构建系统进化树, 根据系统发育树探讨其亲缘关系。 2 结果与分析 2.1 不同菌株的气生引导基 由图1可见, 菌丝长满整个平板时, 白化变异型菌株KB29的菌落颜色为纯白色, 回复突变菌株KH29菌株为淡黄色;而其余3个菌株均为橘黄色。白化变异型菌株KB29和其回复突变菌株KH29的气生菌丝较为发达, 基内菌丝相对较弱 (表1) 。5个供试菌株在固体培养基中的生长速度由快至慢依次为KB29、K17、KH29、K19和A2菌株, 其中A2菌株需要约24d才能长满整个平板。 2.2 各菌株的生长特性 由表2可见, K17菌株子实体长, 粗细均匀, 颜色橘黄, 子囊壳丰富, 出草整齐, 每瓶干重达到4.67g, 经济性状要明显优于其他4个供试菌株。其余依次为A2、K19、KH29和KB29菌株;A2菌株的干重虽然也达到4.66g, 但子实体不光滑且扭曲, 严重影响其外观性状;白化变异型菌株KB29的菌种活力有所退化, 栽培产量较少, 且子实体形态变异严重;回复突变菌株KH29子实体子囊头大, 有毛刺, 但子实体部分较细, 不整齐, 出草有橘黄色, 也有少量白色;K19菌株颜色橘黄, 子囊头也较大, 出草整齐但子实体较细 (图2) 。 2.3 整株菌株的现实测序结果 由图3可见, 5个供试菌株的ITS扩增片段清晰, 大小在500~750bp之间, 且扩增结果稳定, 重复性好, 可以进行系统发育学研究。 ITS序列测定结果表明 (表3) , 5个菌株的ITS序列长度为545~566bp, GC含量为56.11%~57.06%。将所扩增出的5个供试菌株的ITS序列与Genbank中已经登录的序列进行Blastn比对, 结果显示5株菌的ITS序列都为蛹虫草序列, 同源性高达99%。该结果也说明, 不同的蛹虫草菌株间的ITS序列是相对保守的