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哈茨木霉h33g蛋白基因ha09974功能研究 反相互作用因子（transport，tf）也被称为反相互作用因子，直接或间接地与基因启动子区域的环境作用元素相互作用，并对初始基因转移过程进行监督管理。 木霉菌是自然界广泛存在的丝状真菌, 一些木霉菌生长快速、产孢量大、能产生抗生物质或诱导植物抗病性, 对植物病原菌有较强的拮抗能力, 因此作为植物病害生防真菌被广泛应用 1 材料和方法 1.1 质粒及试剂 哈茨木霉Th33、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea Pers.、黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum、质粒pCSN44 (具有潮霉素B抗性基因) 、根癌农杆菌EHA105为本实验室保存;质粒p DHt/SK由美国国立卫生研究院惠赠;质粒p AN7-1和pKH-KO-G418分别由中国农业科学院植物保护研究所土传病害研究组和细菌病害研究组保存。质粒pEASY-T1及E.coli Trans 5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。 真菌DNA小量提取试剂盒E.Z.N.A.?Fungal DNA Kit (OMEGA) 购自江晨生物技术有限公司;小型质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、Fast Quant RT Kit (with gDNase) 、总RNA提取试剂盒TranZol Up RNA购自北京天根生化公司;DNA连接试剂盒Clontech In–Fusion HD Cloning Kit购自北京六合通经贸有限公司;其他试剂为进口或国产分析纯。 引物合成与测序由北京华大基因公司合成有限公司完成, 引物设计通过Primer premier 5软件完成, 引物序列见表1。 1.2 基因克隆与tha09974序列分析 参考Th33全基因组序列 (Gen Bank:PRJNA272949) 1.3 潮霉素b抗性基因敲除 采用同源双交换技术, 构建Tha09974敲除突变株 (图1) 。利用引物1F/1R和2F/2R (表1) , 以Th33基因组DNA为模板扩增转录因子Tha09974基因上、下游同源臂序列。以H1F/H1R为引物, 以质粒p CSN44作为模板, 扩增潮霉素B抗性基因。运用2次重叠延伸PCR (splicing overlap extension PCR, SOE-PCR) 扩增, 首先利用引物H1F/2R将潮霉素B抗性基因与Tha09974基因的下游同源臂连接, 然后利用引物1F/2R, 将上述连接产物与上游同源臂片段相连, 获得Tha09974基因敲除盒。分别对敲除盒和质粒pDHt/SK进行Spe I/Hind III双酶切, 酶切产物用T4 DNA Ligase连接, 获得Tha09974基因敲除载体pDHt/SK-H?9974。在大肠杆菌Escherichia coli Trans5α中复制和保存。 采用根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens EHA105介导的遗传转化方法 (ATMT方法) 1.4 pcr扩增及基因表达载体构建 以哈茨木霉Th33基因组DNA作为模板, 以R9974F/R9974R为引物 (表1) PCR扩增Tha09974基因片段。以质粒pAN7-1作为模板, 以PF/PR为引物PCR扩增PgpdA启动子片段, 以TF/TR为引物PCR扩增TtrpC终止子片段 (表1) 。将Tha09974、PgpdA启动子、TtrpC终止子片段按1:1:1的摩尔浓度比混合, 采用重叠延伸PCR方法将3个片段进行连接。第一步:94℃5 min;95℃55 s, 50℃45 s, 72℃50 s, 15个循环;将启动子片段、Tha09974基因片段、TtrpC终止子片段顺次拼接。取第一步所得PCR产物2μL, 以PF/TR为引物进行第二步PCR扩增, PCR过程为94℃4 min;95℃55 s, 63.5℃45 s, 72℃2 min, 30个循环;72℃5 min;4℃10 min。第二轮PCR产物经测序并验证, 获得Tha09974基因表达盒。将真菌表达载体pKH-KO-G418采用SpeⅠ/NotⅠ双酶切, 酶切产物与Tha09974基因表达盒片段按摩尔比为1:2混合, 用Clontech In-Fusion HD Cloning Kit进行连接。获得Tha09974基因表达载体pKH-KO-G9974 (图1) 。采用PEG介导的原生质体转化法 1.5 菌落培养和生物量测定 分别将哈茨木霉野生型Th33、突变株?9974和回复突变株R9974接种在PDA平板上活化, 培养4 d后, 用直径0.5 cm的打孔器, 分别打取菌饼接种于新的PDA平板中央, 28℃下培养。分别于16、28、40和52 h后测定菌落半