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人类肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转化的调控 肾间质纤维是由于多种因素的影响，肾间质细胞增多，基质分解受抑制，纤维合成增加，导致大量外基质细胞积聚，严重损害肾脏细胞，严重损害组织结构，肾脏肾功能，最终导致肾功能和肾小管钙化。这是所有慢性肾脏疾病发展的共同最终路径。由于肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转化 (EMT) 在肾间质纤维化变化中的重要性已经为人们认识, 所以积极探索有效的预防、抑制甚至逆转EMT的发生对治疗肾间质纤维化有重要意义。已有研究表明血小板源性生长因子 (PDGF) 家族在肾脏病的纤维化发展中起重要作用, 通过抑制PDGF的表达能减轻肾纤维化 材料和方法 一、 酶标记的羊抗兔 人类肾小管上皮细胞 (HKC) 购自中国典型培养物保藏中心。DMEM\F12 (Gibico公司, USA) ;0.25%胰蛋白酶 (Thermo公司) ;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G、胎牛血清 (FBS) (北京中山公司) ;人重组TGF-β 二、 方法 1. 细胞培养和群体培养 将HKC培养于DMEM\F12, 5%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100μg/ml链霉素培养基中, 于37℃、5%CO 2. 细胞无聚甲醛法 测定各组HKC PDGF-BB及VEGF蛋白的表达。获得细胞爬片后, 以冷PBS洗涤3次, 4%多聚甲醛固定20 min后吸干, 加入PBS水化。0.1%Tritonx-100室温30 min, 0.3%H 3. ctgackcacccggaa-3’下游 按Trizol说明书提取细胞中的总RNA, 紫外分光光度机对RNA定量, 用Oligo (d T) 引物进行样品RNA (200 ng) 的反转录, 得到c DNA。α-SMA上游5’-GCTCACGGAGGCACCCCTGAA-3’下游5’-CTGAT-AGGACATTGTTGTTAGCAT-3’。PDGF-BB上游5’-AAGCATGTGCCGGAGAAGCG-3’下游5’-TC-CTCTAACCTCACCTGGAC-3’。VEGF上游5’-AC-CATGAACTTTCTGCTGTC-3’下游5’-TCACCGC-CTCGGCTTGTCAC-3’。甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) 上游5’-CAAGGTCATCCATGA-CAACTTTG-3’下游5’-GTCCACCACCCTGTTGCTG-TAG-3’。RT-PCR反应体系为10×PCR缓冲液2.5μl, Mg Cl 三、 统计学分析 用SPSS 12.0软件对结果中的数据进行统计学分析, 所有数据以均数±标准差表示, 组间比较采用单因素方差分析, 两两比较用LSD检验, P0.05表示差异有统计学意义。 结果 一、 注意hkc形式的观察 倒置显微镜下观察细胞形态, 阴性对照组及阿利吉仑组的HKC在6孔细胞培养版中生长6 d后, 呈椭圆形的形态学特征。TGF-β 二、 免疫组化效果 1. 亚莉亚吉伦对pdgf-bb的影响 阴性对照组和阿利吉仑组PDGF-BB阳性细胞占总HKC的面积比值均很低, 2组之间无差异 (P0.05) 。TGF-β 2. 阿里斯顿对vegf的影响 阴性对照组VEGF阳性细胞占总HKC的面积比值4.925%, 阿利吉仑组与阴性对照组无差异 (P0.05) 。TGF-β 三、 各组pdgf-bbmrna表达比较 阴性对照组有少量α-SMA mRNA表达, 单独阿利吉仑作用24 h后, 较阴性对照组α-SMA mRNA表达量无显著变化 (P0.05) ;TGF-β 阴性对照组有少量PDGF-BB mRNA的表达, 单独阿利吉仑作用24 h后, 较阴性对照组PDGF-BB mRNA表达量无显著变化 (P0.05) ;TGF-β 3. 阿里斯顿对vegfm字体的影响 阴性对照组及阿利吉仑组有微量VEGF mRNA的表达, 2组间无差异 (P0.05) 。TGF-β mdd的临床表现 大量的基础和临床研究都证实了RAS系统活化在慢性肾间质纤维化的进展中起着关键作用。RAS抑制剂可作用于三个位点:抑制肾素活性、抑制ACE活性、阻断AT 在正常生理状态下, 肾小管细胞轻度损伤会导致PDGF分泌的增加, PDGF在完成肾脏细胞修复后会恢复正常水平, 但如果致病因素持续存在则会导致PDGF的过度表达, 促进成纤维细胞大量增殖, 加速成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞, 分泌大量的Ⅰ、Ⅲ型胶原等细胞外基质, 导致细胞外基质聚集, 促进肾纤维化, 损伤肾功能。有研究表明, 在发生肾间质纤维化的大鼠肾间质成纤维细胞中PDGF-D和PDGF-B呈高表达 缺氧、高糖刺激、血管紧张素Ⅱ等多种因素参与了VEGF的表达 本实验发现阿利吉仑可以抑制TGF-β 1. 阿里斯顿对smam芦苇的影响 2. 亚莉亚吉伦对pd