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脐带血造血干细胞分离冻存方法的比较 肚脐出血的原始细胞是具有分解潜力的伦理c。它具有自我更新和复制能力，能够在某些因素的影响或诱导下分裂各种细胞和组织。脐带血造血干细胞移植能修复患者造血机能和免疫功能, 现已广泛应用于恶性血液病、自身免疫性疾病、严重免疫缺陷症的临床治疗 1 试验材料和方法 1.1 试剂和仪器 按照美国脐带血库标准操作规程无菌采集健康、足月分娩产妇的脐带血, 采集后24 h内处理。 所用主要试剂和设备有:DMSO购自Sigma公司;6%羟乙基淀粉生理盐水注射液购自B.BRAUN Medical公司;10%右旋糖酐40生理盐水注射液购自Hospira公司;胎牛血清、IMDM培养基及F12基础培养基购自Gibco公司;CD34、CD45抗体购自Beckman Coulter公司;台盼蓝试剂盒购自碧云天公司;甲基纤维素培养基购自美天旎公司;血细胞分析仪KX-21N购自希森美康医用电子 (上海) 有限公司;生物安全柜HFsafe1200A2购自力新仪器 (上海) 有限公司;大容量低温冷冻离心机J6-MI购自Beckman Coulter公司;程控降温仪GDKRY0750PLUS购自Britain Planer公司。 1.2 测试方法 1.2.1 富红细胞血浆的制备 利用离心沉降法和自然沉降法分离脐带血有核细胞, 计算有核细胞回收率和红细胞回收率, 比较两种分离方法的分离效果。 离心沉降法:将6%的羟乙基淀粉注射液和脐带血按照1∶5的比例混合, 慢速摇匀10 min, 以50g、10℃离心7 min, 收集上层富白细胞血浆, 再以400 g、10℃离心15 min, 去除血浆。 自然沉降法:将6%的羟乙基淀粉注射液和脐带血按照1:5的比例混合, 慢速摇匀10 min, 悬挂让其内细胞自然沉降1 h后, 收集上层富白细胞血浆, 同样以400 g、10℃离心15 min, 去除血浆。 1.2.2 冷冻保护剂 将分离后的脐带血分别与4种不同的冷冻保护剂混合, 脐带血与冷冻保护剂的体积比为4∶1, 混合时应将冷冻保护剂缓慢注入脐带血中, 边注入边晃动。用程控降温仪按以下程序降温, 4℃保持10 min, 以-1℃/min的速率降温至-40℃, 再以-10℃/min的速率降温至-80℃, 完成后将脐带血混合物放入液氮罐中储存。4种冷冻保护剂分别为:DMSO和0.9%氯化钠溶液1∶1混合液, DMSO和6%右旋糖酐1∶1混合液, DMSO和6%羟乙基淀粉1∶1混合液, DMSO、胎牛血清和F12培养基9∶4∶5混合液。冷冻保护剂新鲜配制并于4℃提前预冷。 1.2.3 不同冷冻保护剂对冻存效果的影响 脐带血冻存3个月后, 将冻存的脐带血在37℃水浴锅中复苏, 测细胞存活率, 用流式细胞仪进行造血干细胞表面标志等分析, 并进行祖细胞集落培养, 从而比较4种冷冻保护剂的冻存效果的差异性。 1.2.4 细胞总体重悬液 取100μL脐带血样品, 加入900μL氯化铵溶血素, 4℃避光反应5 min, 200 g离心5 min, 弃上清加入细胞重悬液900μL重悬, 再取50μL混合液加入台盼蓝2X溶液50μL, 静置3 min后计数。每个样品至少数300个细胞, 计算有核细胞存活率。 1.2.5 流式细胞仪的检测 计数CD34 1.2.6 祖细胞聚集和培养 集落形成分析是一种检验造血干祖细胞活性公认的敏感方法 1.2.7 不同试剂的冻存效果 选择上述研究中最佳冷冻保护剂, 采用相同的试剂和方法, 比较同一份脐带血样本冻存前、冻存3个月、6个月和一年的存活率、有核细胞数、CD34 1.2.8 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行数据分析, 测定结果均按平均值±标准差表示, 统计学处理采用区组设计的方差分析, 显著性水平为P0.05。 2 试验结果 2.1 自然沉降法 离心沉降法有核细胞回收率为83.60%±9.44%, 自然沉降法有核细胞回收率为86.40%±8.49%, 二者之间差异无显著性意义 (P0.05) , 但离心沉降法所需时间更短, 操作简便, 更适合脐带血库。 2.2 各组细胞回收率的比较 4种冻存液冻存的细胞复苏后有核细胞回收率和存活率结果见表1。结果表明:第4种冷冻保护剂冻存的细胞复苏后有核细胞回收率与前3种的差异有极显著意义 (P0.01) , 且数据偏低不能达到要求;第1, 2, 3种冷冻保护剂复苏有核细胞回收率的差异无显著意义 (P0.05) ;4种冷冻保护剂复苏细胞存活率的差异有极显著意义 (P0.01) , 其中第2种和第3种差异不显著, 复苏后存活率最佳。 2.3 恢复后流的分析与祖细胞培养 4种冷冻保护剂冻存的细胞复苏流式分析和祖细胞培养结果见表2。4种冷冻保护剂冷冻的细胞复苏CD34 2.4 护剂dmso