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木素对麦草纤维素酶解的影响 纤维物质是一个潜在的物质资源数据库。这是人类未来能量、食品和化学原因的重要来源。纤维物质是由纤维素、半纤维素和木质素构成的复杂物质,而纤维素是由若干失水葡萄糖链节所组成的高分子化合物,本身具有结晶区域,同时又被木质素和半纤维素包围着,形成了一种很牢固的结构。完整的纤维素高度不溶于水,难于被降解[1～3],所以,破坏木质素保护层和改变纤维素的晶体结构,可促进纤维素的降解,提高其利用率。在酶促降解、直接微生物降解及酸催化水解以前,对纤维素原料进行预处理有利于纤维素的降解,提高其转化率[4～6]。本文采用碱-氧-蒽醌预处理麦草以最大限度地脱除木质素,降低纤维素的聚合度,探讨纤维素酶解的影响因素,为纤维素的利用提供一定的理论依据。 1 实验部分 1.1 原材料和组成 麦草取自北京造纸厂,其化学组成分析如下: 纤维素酶购自上海丽珠东风生物技术有限公司,酶活≥15000U/g。 1.2 纤维素的制备 在2L带搅拌、自动控温、不锈钢高压釜中,用氧-碱-蒽醌蒸煮麦草,反应结束后,产物经过滤、水洗、干燥得到纤维素原料。 1.3 酶解三角瓶的制备 称取一定量用微型植物粉碎机粉碎至80目的纤维素,放于装有一定pH的乙酸钠-乙酸缓冲溶液的三角瓶中,加入一定量的纤维素酶,在一定的酶解时间和酶解温度下,放入一定转速的恒温摇床中进行酶解反应。反应结束后,经过滤得酶解液,分析测定酶解液中的糖含量并计算酶解率和纤维素中木素脱除率。 1.4 纤维素中木素含量的测定 酶解液中糖含量的测定:采用3,5-二硝基水杨酸比色定糖法进行;木素含量的测定参见文献。 纤维素酶解率和纤维素中木素脱除率分别按下式计算: 其中,纤维素中木素含量为2.2%。 红外分析采用KBr压片法,用PEKIN-ELMERSYSTEM 2000FTIR仪器进行测试。 2 结果与讨论 2.1 木素含量对纤维素酶解的影响 用氧-碱-蒽醌蒸煮麦草,在不同的蒸煮时间下取样得到不同木素含量的纤维素,对其进行酶解,考察木素含量对纤维素酶解的影响,其结果如图1所示。随着纤维素中木素含量的增加,酶解率降低,木素含量越低,酶解率越高。说明木素的存在对纤维素酶解有很大的影响,木素起着屏蔽作用,木素含量越高,这种屏蔽作用就越大,从而降低了酶解率。 2.2 酶解纤维素的性质 由图2可知,随着酶量的增加,纤维素酶解率和木素脱除率增大,在5g底物中,酶量在100mg之前,酶解率和木质素脱除率增加较快,100mg之后,虽然二者也在增加,但增加的速度减缓。因为一定量的纤维素在一定的粉碎程度下,纤维素分子能和酶分子结合的结合点数量是有限的,当这些结合点全部被纤维素酶分子占据后再增加纤维素酶的用量,新增加的那部分酶分子无法和纤维素分子结合,因此起不到酶解反应。Briggs-Haldane稳态学说认为: 随着酶量[E]的增加,开始时反应向右进行,生成中间复合物[ES],随着[ES]的积累不断生成产物[P],但当酶量[E]过量时,反应向左进行,抑制了产物的生成,影响了酶解率。另一方面,从经济的角度考虑,酶用量也要尽可能的少。当裸露的纤维素分子与酶分子结合后,附着在纤维素上的木质素失去了支撑底物,所以,纤维素酶解的同时木质素也被脱除下来,从而增加了木质素的脱除率。 2.3 酶解率和木素脱除率 大部分酶的活性受其环境pH的影响,在一定的pH条件下,酶反应具有最大速度,高于或低于此值,反应速度下降。图3显示了pH对纤维素酶解的影响规律,随着pH的增加,酶解率和木素脱除率增大。当pH=4.4时,二者达最大,之后,随着pH的增加,二者下降。因为,一般的酶制剂对pH值比较敏感,只有在很小的范围内起作用,不同的酶所适应的值范围是不同的,过高或过低都不利于酶解反应的进行,pH的改变可以破坏酶的空间构象,引起酶活的丧失,还能影响酶活性中心催化基团的解离,使底物转变成产物的过程受到影响,同时pH的改变影响酶活性中心结合基团的解离状态和底物的解离状态,使得底物不能与其结合或结合后不能生成产物。实验结果表明pH为4.4时,酶解率最高。 2.4 反应时间对酶解的影响 如图4所示,随着酶解时间的增加,酶解率增大,同时木质素的脱除率也在增大。说明适当延长酶解时间可增加酶解率,但过多地延长酶解时间,酶解率增加减慢,因为随着时间的增加,纤维素酶分子与底物发生充分的反应,由2.1中的反应式可知,[S]随时间增加而降低,[P]相应增高,中间复合物[ES]在一开始增高,可在一段时间内保持浓度的恒定,在这段时间内,[ES]的生成速度和[ES]的消失速度相等,反应达到动态平衡,即使增加反应时间也不能增加酶解率。而且,当纤维素的酶解产物积累到一定程度时,反过来又抑制了酶的活性,降低了酶解反应的进行,同时,底物的吸附位点已全部被酶分子占据,达到了饱和。因此