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饲料中木聚糖酶活性分析与检测方法的研究进展 木聚糖酶是饲料中的一个重要成员。在世界范围内，65%75%的粮食饲料中引入了以木聚糖酶为主的非淀粉多糖酶。木聚糖酶不但能有效改善饲料营养价值, 还能促进动物生产性能的提高, 是当前消除饲料中木聚糖抗营养作用最为有效可行的措施之一。同时, 木聚糖酶的应用也为缓解能量饲料资源的短缺、开辟非常规饲料资源提供了新的途径。 饲用酶制剂活性分析与检测在饲料工业中具有重要的作用:一是酶制剂生产企业可用于检验监控每批产品质量的稳定性;二是添加于饲料中的酶制剂在与饲料一起经过加工制粒工艺后, 势必会造成酶活性的损失, 因此饲料加工工业可以通过检测成品饲料中酶制剂的含量来验证其添加效果 (即饲料中酶的存活率) , 以保障饲料品质。 目前, 我国仍缺乏统一的饲用木聚糖酶检测方法, 而丹磺酰氯 (DNS) 还原糖法由于具有操作简便, 显色稳定, 重现性好, 且不需特殊仪器设备等优点, 成为了众多科研单位和饲料酶制剂生产企业公认的测定方法。由于加酶饲料中木聚糖酶的添加量较少, 且存在着较多的干扰因素, 使得木聚糖酶的准确测定变得较为困难, 这已成为许多饲用酶制剂科研工作者、生产者和使用者普遍关心的问题。因此, 本文归纳了饲料中木聚糖酶检测的影响因素;同时在DNS还原糖法的基础上提出了酶活梯度曲线检测法的概念, 以期为检测饲料中木聚糖酶的方法提供可行性参考。 1 影响检测加酶饲料中木聚糖酶的因素 1.1 饲料本身的干扰因素 1.1.1 木聚糖酶显色剂的确定 植物性饲料中含有多种碳水化合物, 如淀粉、木聚糖、纤维素及果胶等。这些碳水化合物含有不等量的还原性醛基, 在煮沸条件下均可与DNS显色剂发生显色反应。在浸提饲料的木聚糖酶的过程中, 饲料本身含有的一些可溶性碳水化合物也会随之溶入浸提酶液中, 其具体含量见表1。 由于浸提酶液中含有大量的碳水化合物, 使得酶活测定过程中背景值较高, 增加了检测误差。此外, 在制粒、膨化等加工过程中, 饲料原料中的一些不可溶或溶解性较差的多糖也可能会在高温高压的作用下裂解, 提高溶解性, 而进一步增加了浸提酶液中可溶性碳水化合物的变异度。 1.1.2 木聚糖酶的抑制机理 矿物金属离子对酶制剂活性的作用表现为两方面:一是作为酶必不可少的辅助因子, 稳定酶的构象, 起激活剂的作用;二是当金属离子浓度过大或为重金属离子时, 会影响底物与酶的结合甚至使酶变性失活, 起抑制剂的作用。魏有霞等报道, Na+、K+、Fe3+对木聚糖酶的活性有激活作用;Fe2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+对木聚糖活性具有抑制作用, 且抑制能力依次增大。李卫芬等报道, Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+对木聚糖酶活性有抑制作用, 且Cu2+抑制作用最强;Co2+、Mn2+则能促进其活性, 其他离子对木聚糖酶活性影响较小。王在贵等的研究则发现, 包括Ca2+、Fe2+、Mn2+在内的多种二价金属离子对木聚糖酶活性均有不同程度的抑制作用。由此可见, 金属离子对木聚糖酶活性的影响是一个较为复杂的过程。 饲料中含有数量可观的矿物金属离子, 其一方面来源于饲料原料, 另一方面则是根据动物营养生理的需要, 在饲料配制过程中添加的常量和微量矿物元素。在浸提木聚糖酶的过程中, 饲料中含有的一些矿物金属离子也会随之溶入酶液, 并对后续酶活力的测定产生促进或抑制的影响, 从而干扰了酶活检测。此外, 饲料中含有的矿物金属离子 (如Fe2+、Cu2+等) , 其自身的水溶液就有一定的颜色, 因此也会影响待测酶样本的底值, 增加检测误差。 1.1.3 饲料系酸力对提取酶液ph的影响 饲料系酸力是指用1 mol HCl滴定100 g饲料的水溶液, 当pH下降到4.0时所消耗的盐酸量。饲料原料的选择及各原料组分间的比例影响着饲料系酸力;同时, 动物种类及日龄上的不同对日粮系酸力的要求也有一定的差异性。在浸提加酶饲料中木聚糖酶的过程中, 饲料自身的系酸力会对提取酶液的p H产生不同程度的影响。笔者做了如下试验:从市场收集6份 (A~F) 不同饲料样品并粉碎过40目筛, 分别各称取样品5.0 g于100 mL容量瓶中, 加入pH 5.5缓冲液70 mL, 置于恒温振荡器中摇匀30 min, 定容、离心后取上清液测定pH, 结果见表2。 由表2可见, 受饲料系酸力的影响, pH 5.5的缓冲液在浸提饲料之后, 其浸提液的pH已偏离5.5。故建议在检测加酶饲料中木聚糖酶的含量时, 应先用pH计对浸提的酶液校正调节后再进行酶活测定以降低检测误差。 1.1.4 木聚糖酶的检测 在饲用酶制剂的应用过程中, 木聚糖酶可以与纤维素酶、果胶酶等经过复配后以复合酶的形式添加应用于饲料中。故在浸提此类饲料木聚糖酶的过程中, 其他酶也会溶于酶液中。这些酶催化水