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高效液相色谱法测定叶木草素的含量 黄酮类化合物广泛分布于植物边界，主要存在于植物果实、种子、花和叶中。它们是具有抗逆、抗肿瘤、抗过敏等多种生物活性的多酚类化合物。木樨草素有消炎、抗过敏、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、降低兔实验性动脉粥样硬化程度和降胆固醇等作用。竹叶黄酮相对其他植物提取具有明显的优势,安全无毒,同时竹叶提取物良好的工艺特性使得竹叶黄酮的应用前景更为广阔。竹叶提取物中总黄酮含量测定的方法报道很多,但关于竹叶提取物中木樨草素含量的测定报道很少,笔者以期建立高效液相色谱测定竹叶提取物中木樨草素含量的方法,为竹叶提取物中木樨草素含量的测定提供更简便有效的方法。 1 材料和方法 1.1 设备 Waters2695-2487高效液相色谱仪;Sartorius BP221S 分析天平;超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)。 1.2 黄酮提取物 木樨草素对照品购于杭州天草生物科技有限公司,竹叶黄酮提取物购于浙江安吉圣氏生物制品有限公司和金华贝康生物制品有限公司 。甲醇和乙腈均为色谱纯,水为超纯水,其他试剂为国产分析纯。 1.3 测试方法 1.3.1 对照品溶液的制备 准确称取1.7 mg木樨草素标准品,置于10 ml容量瓶中,加入甲醇超声溶解并定容至10 ml,摇匀即得0.17 μg/L的木樨草素对照品溶液。准确移取0.1、0.3、0.5、0.7和1.0 ml对照品溶液至2 ml容量瓶中,用甲醇定容,备用。 1.3.2 样品溶液的制备 准确称取40.0 mg竹叶黄酮提取物,置于250 ml容量瓶中,用甲醇超声溶解并定容至250 ml,过0.45 μm滤膜,待测。 1.3.3 添加可重复试验 将竹叶提取物用甲醇溶解后,取3份相同的样品,加入3种不同浓度的木樨草素对照品溶液,每个浓度作5个平行。 1.3.4 梯度曲线及流动相梯度 色谱柱为YMC-ODS-A ,流动相A为乙腈,B为0.5%磷酸缓冲液,采用梯度洗脱,梯度曲线(curve)、流动相梯度程序见表1,检测波长为335 nm,流速为1.0 ml/min,柱温为25 ℃,进样量为10 μl,木樨草素的保留时间在38 min。 2 结果与分析 2.1 色谱稳定性试验 分别取木樨草素标准品和黄酮提取物样品溶液10 μl,按照上述的色谱条件进样,得到木樨草素的保留时间在38 min左右,样品在38 min也有明显的峰,试验结果说明色谱系统具有良好的适应性和专属性。如图1、2所示。 2.2 标准曲线的绘制 取上述配好的标准品溶液10 μl进样,以木樨草素进样量x为横坐标,峰面积y为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程为y=36 303x-3 635.2,R2=0.999 6。结果表明木樨草素在0.2～14.0 mg/ml与峰面积具有良好的线性关系。 2.3 准确度的研究 取同一浓度的标准品溶液10 μl连续进样6次,测得峰面积的RSD为0.36%,表明仪器精密度良好。 2.4 稳定性试验 取样品10 μl在0、1、2、6、8 h进样,在0～6 h测定木樨草素峰面积RSD为0.90%,表明样品在6 h内比较稳定。 2.5 加样回收率和rsd 取同一竹叶黄酮提取物3份,加入3种浓度的对照品溶液,按照上述色谱条件进样,得到平均回收率为112.74%,RSD为2.45%。结果见表2。 2.6 草素的含量 根据上述检测条件进样测得样品的浓度:浙江安吉圣氏生物制品有限公司产品的木樨草素含量为1.957 5 mg/g,金华贝康生物制品有限公司产品的木樨草素含量为1.635 0 mg/g。 3 流动相法分离 目前有关竹叶提取物中总黄酮的测定已有大量的报道,但仅测定竹叶提取物中木樨草素的文献少见。笔者利用高效液相色谱建立了测定竹叶提取物中木樨草素含量的方法,该方法较简单、方便。 张晶等采用高效液相色谱法测定木樨草素含量时,流动相配比是固定的。竹叶提取物中主要的活性成分为黄酮类物质,且种类较多。 木樨草素是黄酮类物质的一种,由于性质相似,在固定流动相的情况下,竹叶提取物中的黄酮类物质包括木樨草素在分离检测过程中很难获得很好的分离,该试验采用梯度洗脱,取得了很好的分离效果,为进一步分离检测竹叶提取物中黄酮提供一定依据。文献中很多方法采用350 nm或者254 nm作为检测波长,但该试验使用350 nm检测,峰型有一定前延,采用335 nm后,峰型有了较好的改观。