复方守宫散对裸鼠皮下胃癌组织中vegf、bfgf的影响.docxVIP

复方守宫散对裸鼠皮下胃癌组织中vegf、bfgf的影响 1973年，folkma首次提出肿瘤生长和转移对血管的依赖，肿瘤血管生长调节机制和抗血管生成对肿瘤治疗的重要性。近年来, 随着对肿瘤血管生成机制研究的不断深入, 抗血管生成药物也得以快速研发, 其中对天然药物及其组分的研究占有相当大的比例。我们在既往研究的基础上设计了该课题, 目的在于明确复方守宫散抗胃癌血管生成作用, 阐明其作用机制, 为开发具有抗肿瘤血管生成作用的中药新药提供理论基础和实验数据。 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 中药剂量确定 鼠抗人VEGF单抗隆抗体、鼠抗人b FGF单抗隆抗体、鼠抗人CD-34单克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司;SP超敏试剂盒、DAB购于福州迈新生物技术有限公司。另外, 实验用药中药剂量确定:复方守宫散按照传统煎煮法, 低、中、高剂量组药物浓度根据人与动物体表面积与计量换算法计算, 低剂量组:1mg/kg/d, 中剂量组:2mg/kg/d, 高剂量组:4mg/kg/d, 分别相当于临床等效剂量的1/2、1、2倍。根据5-氟脲嘧啶的LD50为117.2mg/kg, 注射用量为LD50的1/3~1/5, 参考文献选用剂量20mg/kg/d。 1.1.2 动物g,男性 BALB/C-nu/nu裸鼠, 4~6周龄, 体重18~20g, 雄性, 在安徽医科大学动物实验中心无特殊病原体 (Specific pathogens free, SPF) 条件下分笼饲养, 自由觅食、饮水, 由上海斯莱克实验动物有限公司提供。 1.2 方法 1.2.1 瘤块的切割 将带有胃癌MKN-45瘤体生长良好的裸鼠以颈椎脱臼法处死, 取出瘤块置生理盐水中切割成1.5~2.0mm 3小块备用。将瘤块轻推入套管针内, 左手固定裸鼠偏右侧, 皮肤消毒后, 将带有瘤块的套管针刺入BALB/C-nu/nu裸鼠右侧腋下皮肤, 瘤块植入皮下即可。 1.2.2 复方守宫散治疗ss 裸鼠皮下瘤块植入约一周左右即可见圆形小皮丘, 待肿瘤直径长至0.5~0.7cm (约20d左右) 时, 将裸鼠随机分为5组, 每组3只, 具体分组及给药如下: (1) 阴性对照组 (NS组) :灌胃, 生理盐水0.2ml/d, 6周; (2) 5-氟脲嘧啶组 (5-Fu组) :腹腔注射, 5-Fu 20mg/kg/d, 3周; (3) 复方守宫散低剂量组 (Sgs1组) :灌胃, 1mg/kg/d, 6周; (4) 复方守宫散中剂量组 (Sgs2组) :灌胃, 2mg/kg/d, 6周; (5) 复方守宫散高剂量组 (Sgs3组) :灌胃, 4mg/kg/d, 6周。实验过程中定期 (间隔3~4天) 测量肿瘤大小, 并称量裸鼠体重。 1.2.3 免疫组化阳性表达指数检测 采用S-P免疫组织化学法 (Immunohistochemistry, IHC) 对裸鼠皮下胃癌组织中VEGF、b FGF等蛋白表达进行检测, 操作方法参见说明书。阳性染色为棕黄色颗粒, 定位于细胞浆和 (或) 细胞核中, 观察染色切片中具有代表意义的高倍视野, 以上述方法分析每个视野中的阳性面积和相应OD值作为结果, 免疫组化阳性表达指数=阳性面积比×OD值。比较各组免疫组化阳性表达指数。 1.3 统计分析 所有数据均以平均值±标准差 (ue0af±s) 表示。采用SPSS11.5统计软件进行分析, P0.05表示差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 生长情况及分组 BALB/C-nu/nu裸鼠皮下接种人胃癌MKN-45瘤块后, 所有动物均于一周左右出现肉眼可见的皮下圆形小结节, 大约20 d左右肿瘤直径长至0.5~0.7cm, 接种成功率为100%。经随机分组后, 在给药1周左右化疗组部分动物开始出现消瘦、活动减少, 饮食有不同程度减少的现象, 而中药组则在2周左右才开始出现类似情况, 而且中药组生长状况明显优于5-Fu对照组及NS组。给药2周左右, 5-Fu对照组有裸鼠出现衰竭症状, 消瘦呈弓背状, 肋骨隐约可见, 活动受限, 腹部膨隆或呈蛙形腹, 遂结束实验, 牺牲所有实验动物。 (见图1) 。 2.2 复方守宫散及5-sf组裸鼠肿瘤生长情况 实验结果显示, 治疗前各组裸鼠肿瘤大小无明显差异 (P0.05) , 提示各组瘤体具有可比性。在治疗过程中, 生理盐水组裸鼠肿瘤生长较快, 个别肿瘤表面有破溃倾向, 而复方守宫散及5-Fu组裸鼠肿瘤生长相对缓慢。治疗结束后复测肿瘤大小, 结果显示, 复方守宫散各组及5-Fu组肿瘤体积明显小于生理盐水组 (P0.05) , 其中复方守宫散组随着给药剂量的增大其相对肿瘤增殖率逐渐减小, 说明复方守宫散组抑制肿瘤生长的作用存在剂量依赖性, 与5-Fu组比较差异无统计学意义