球孢白僵菌选择性培养基的筛选及其应用.docxVIP

球孢白僵菌选择性培养基的筛选及其应用 科贝沙林白僵尸菌作为一种重要的昆虫存在，已被广泛用于海防、农业害虫防治等疾病的预防和处理。近年来,该菌被用于防治林木种实害虫。结果表明,此菌具有一定的应用前景。病原菌在土壤中存活时间的长短及种群数量的多少,是影响其防治持效性的关键。土壤是一个相对复杂的环境,病原菌受到诸多因素的影响,特别是土壤中微生物种类较多,数量较大,用常规方法较难准确地检测出它在土壤中的含量。迄今,应用较多的是利用选择性培养基快速分离和测定分生孢子。Veen等利用改良的Martin氏培养基成功地分离了球孢白僵菌和绿僵菌Metarrhizium anisopliae;Doberski等利用其设计的选择性培养基可使球孢白僵菌生长良好,并可用于快速鉴定;Lingg利用Heck发明的培养基在土壤球孢白僵菌孢子浓度大于5×102个·g-1时,回收率达50%。高步衢等报道球孢白僵菌是林木种实害虫球果花蝇Strobilomyiaspp.的一种常见致病微生物。作者在总结前人试验的基础上,进一步筛选出检测施菌土壤中球孢白僵菌分生孢子的选择性培养基,并应用该培养基测定施菌后落叶松Larix gmelini林下球孢白僵菌的动态,研究它在土壤中的防治持效性。 1 材料和方法 1.1 试验材料 1.1.1 试验试剂 球孢白僵菌从辽宁省西丰县自然感病的球果花蝇越冬蛹中分离而得,菌粉由河北省隆化县十八里汰球孢白僵菌厂生产,含孢量为50亿个·g-1。 1.1.2 岭落叶松林下各施菌区和对照区 土样采自辽宁省西丰县、黑龙江省大兴安岭落叶松林中的施菌区和对照区。感病试验在辽宁省西丰县德丰林场日本落叶松Larix kaempferi母树林。 1.1.3 e-nb-3-甲基苯磺酸酯pcnb的合成 葡萄糖、蛋白胨、硫酸铜(CuSO4·5H2O)、950 g·kg-1五氯硝基苯(PCNB)、高锰酸钾、结晶紫、孟加拉红、放线菌酮和氯霉素。 1.2 测试方法 1.2.1 生长情况的测定 以不加染色剂(结晶紫)的Doberski选择性培养基作为基本培养基,加大不同剂量的杀菌物质硫酸铜、五氯硝基苯、高锰酸钾及兼有抑菌作用的染色剂结晶紫和孟加拉红,用量见表1。氯霉素、放线菌酮和硫酸铜在培养基冷却到40 ℃时加入,其余物质在灭菌前加入。五氯硝基苯用乙醚溶解后加入1 g·kg-1吐温80制成乳剂后加入培养基。称取1 g菌粉放入盛有99 mL含1 g·kg-1吐温80的灭菌水中,振荡20 min,取孢子液10 mL转入90 mL灭菌水中,得到5×109个·L-1的孢子稀释液。取土样5 g放入量筒,加5×109个·L-1孢子液1 mL,加水至500 mL搅动悬浮液,转至1L三角瓶中振荡20 min,在悬浮液静止前用吸管吸取10 mL转入90 mL灭菌水中得到稀释10-3倍的土壤悬浮液,用同样方法使之稀释至10-4倍。将不同配方的培养基倒入9 cm的培养皿中,每皿加入0.5 mL的10-4倍土壤悬浮液,采用稀释平板法检测孢子。每处理10皿,3个重复,25℃保湿培养,逐日观察生长情况。9 d后统计结果,在高倍解剖镜下(8.2×10倍)观察鉴别球孢白僵菌。 利用筛选出的选择性培养基和Doberski培养基作检测球孢白僵菌的对比试验,土壤为未施菌的落叶松林下土,稀释方法同上,每处理10皿,6个重复,9 d后检查统计目标真菌及非目标真菌及细菌菌落数。 1.2.2 土壤稀释法检测 林间接种感病试验施菌量为1~500 g·m-2。取林间接种感病试验处理区和对照区的土样,用上面筛选出来的选择性培养基进行检测。第2年及第3年仍然于第1年取样的处理及对照区取土样,测定球孢白僵菌在土壤中的持久性。取样方法为用直径为4 cm的金属采土管,取林内落叶层下地表5 cm的土样。每样方取土样3个,3个重复。将每处理所取土样混合后装入塑料袋,带回室内进行测定。土壤稀释法同上,取样前将土壤充分搅拌均匀,取5 g土样放入1 L三角瓶中,加入495 mL含1 g·kg-1吐温80的灭菌水,振荡30 min,把不同土样分别稀释10-3,10-4和10-5倍,对照区土样为10-3倍。低剂量土样(1~50 g·m-2)为10-4倍;高剂量土样(100~500 g·m-2)为10-5倍。每处理30皿,9 d统计菌落数,计算出每克土壤中所含的孢子数。 2 结果与分析 2.1 培养基结构对目标真菌的影响 以Doberski选择性培养基检测落叶松林下土壤时,放线菌和细菌很少,基本不影响检测效果,但有时非目标真菌出现数量较多,而且有生长较快的扩展性真菌,如毛霉和根霉等影响目标真菌的测定。为此,在该选择性培养基的基本配方上加入了不同剂量的杀菌物质及兼有抑菌作用的染色剂,结果见表1。 对各处理间目标真菌的出现数(个·皿-1)进行协方差分