两个颗粒微生物检查法的建立.docxVIP

两个颗粒微生物检查法的建立 根据《中国药典》2005年版的规定，对样品的微生物限制试验进行应进行首先的方法验证，并确认在检验方法和检验条件下，样品中不存在抑制作用，以确保样品中污染的微生物能完全检测。对于具有抑菌作用的中成药, 由于抑菌活性的干扰, 用常规法检查微生物限度的结果不能真实反映药品微生物污染的情况, 须先消除供试品中的抑菌活性, 再根据《中国药典》规定的方法进行检查。不同品种的抑菌作用强弱不同, 要消除其抑菌活性所采用的方法也不相同, 因而须对每个品种建立适宜的微生物限度检查法。本文建立了热毒清和通淋排石颗粒的微生物限度检查法, 可用于制剂的质量控制。 1 实验材料 1.1 抗菌、苯丙氨酸cmcc 大肠埃希菌[C M C C (B) 4 4 1 0 2], 枯草芽孢杆菌[CMCC (B) 63501], 金黄色葡萄球菌[CMCC (B) 26003], 白色念珠菌[CMCC (F) 98001], 黑曲霉[CM CC (F) 98003], 均由中国药品生物制品检定所提供。 1.2 培养基和培养基 营养肉汤培养基、真菌培养基、营养琼脂培养基、真菌琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、MUG培养基、pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液等均为北京三药科技开发公司生产。 1.3 样品 热毒清颗粒 (批号:070723) 和通淋排石颗粒 (批号:070813) 均由珠江医院制剂室生产。 2 方法和结果 2.1 黑曲霉精液的制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中, 置30℃~35℃培养20 h~24 h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至真菌培养基中, 23℃~28℃培养24 h, 然后用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释, 制成50~100 cfu/mL的悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至真菌琼脂斜面培养基中培养5 d~7 d, 加入3 m L~5 m L0.9%无菌氯化钠溶液, 将孢子洗脱。然后, 吸出孢子悬液 (取少量无菌棉花塞到菌液上方, 用无菌圆口滴管, 吸口顶住棉花) 至无菌试管中, 用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释, 制成50~100 cfu/mL的孢子悬液。 2.2 试验溶液的制备 称取样品10 g, 加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL, 制成1∶10均匀的供试液。 2.3 方法验证 2.3.1 供试品及回收率试验 试验组:取1:10供试液1 mL和上述50~100 cfu/mL的5种菌悬液1 mL, 分别注入灭菌平皿中, 迅速倒入15 mL~20 mL的琼脂培养基 (45℃左右) , 轻轻摇匀, 待凝, 每个菌株做2个平皿。细菌在30℃~35℃培养箱中培养48 h, 真菌在23℃~28℃培养箱中培养72 h, 点计菌落数, 取均值。 菌液组:取上述50~100 cfu/mL的5种菌悬液1 mL, 分别注入灭菌平皿中, 同法进行试验, 测定加入的试验菌数。 供试品对照组:按试验组的方法, 不加菌液, 同法试验, 测定供试品的菌数 (本底菌数) 。 回收率 (%) = (试验组菌数-供试品对照组菌数) /菌液组菌数×100%, 供试品对5个试验菌的回收率结果见表1。 结果表明, 样品对所有试验菌均无抑制作用, 可用常规法检查两制剂的霉菌、酵母菌和细菌数。 2.3.2 胆盐乳液的制备 试验组:取10 mL供试液及10~100 cfu/mL的大肠埃希菌悬液1 mL, 加入100 mL的胆盐乳糖培养基中, 35℃~37℃培养24 h。 阴性对照组:取10 mL供试液及10~100 cfu/mL的金黄色葡萄球菌悬液1 mL, 加入100 mL的胆盐乳糖培养基中, 35℃~37℃培养24 h。 上述培养物转种至MUG-蛋白胨培养基, 培养后通过荧光和靛基质试验判断结果, 见表2。 3 消除抗菌薄膜过滤法 当供试品具有抑菌活性时, 可以采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等消除。本试验结果表明, 热毒清颗粒和通淋排石颗粒均无抑菌作用, 故两制剂均可采用常规法进行微生物限度检查, 以控制的质量。