补肾健脾方对脾肾两虚型大鼠骨质疏松症的治疗作用.docxVIP

补肾健脾方对脾肾两虚型大鼠骨质疏松症的治疗作用 中医认为，骨质疏松症的发生与脾虚是其根本原因。脾虚是主要原因之一。脾虚与肾虚有关。因此,补肾法、健脾法及补肾健脾法均是骨质疏松症治疗的重要法则。本研究在此理论基础上,深入探讨补肾健脾方对脾肾两虚型大鼠骨质疏松症的治疗作用,对补肾法、健脾法以及补肾健脾法对其的治疗作用进行对比分析,以期为骨质疏松发生过程中脾肾相关性研究提供实验依据。 材料表面 1. 强、弱、小分子的风险 选用健康雌性SPF级Wistar大鼠86只,体质量200-220g,由中国药品生物制品检定所提供,许可证编号:SCXK(京)2009-0017,在中日友好医院临床研究所动物室屏障系统饲养,实验动物室许可证号:SYXK(京)2010-0011。 补肾方药采用龟鹿二仙汤,组成:龟板胶9g,鹿角胶6g,人参9g,枸杞9g,常规水煎制,含量为3.04g生药/kg,给药浓度为0.304g/m L。健脾方药采用四君子汤,组成:人参9g,茯苓9g,白术9g,甘草6g,常规水煎制,含量为3.04g生药/kg,给药浓度为0.304g/m L。补肾健脾方药采用龟鹿二仙汤合四君子汤,组成:龟板胶9g,鹿角胶6g,人参9g,枸杞9g,茯苓9g,白术9g,甘草6g,常规水煎制,含量为5.26g生药/kg,给药浓度为0.526g/m L。己烯雌酚:合肥久联制药有限公司生产(批号,规格:每片1mg,使用时用蒸馏水制成浓度为0.0046mg/m L的混悬液,给药体积为1m L/100g体质量,给药剂量为0.046mg/kg体质量。大黄浓煎液:川大黄,水煎制,浓缩至200%。 甲基丙烯酸甲酯由北京益利精细化学品有限公司生产(批号;甲基丙烯酸丁酯由北京益利精细化学品有限公司生产(批号:980716);聚乙二醇400由北京化学试剂公司生产(批号:050425);苯甲酸甲酯有华北地区特种化学试剂开发中心(天津)生产(批号:980923);过氧化苯甲酰由北京金龙化学试剂有限公司生产(批号;N,N-二甲基对甲苯胺(N,N-Dimethyl-p-toluidine)由ALDRICH公司生产(批号:04327MB-235)。Ⅰ液:100m L甲基丙烯酸甲酯+35m L甲基丙烯酸丁酯+5m L苯甲酸甲酯+1.2m L聚乙二醇400;Ⅱ液:Ⅰ液+0.4g干燥过氧化苯甲酰;Ⅲ液:Ⅱ液+0.8g干燥过氧化苯甲酰;戊巴比妥钠由美国Sigma公司生产(批号;盐酸四环素由美国Amresco公司生产(批号。 LEICA CTR6000显微镜:德国Leica公司;LeicaQwin图像分析仪系统:德国Leica公司;冷冻切片机:英国TBS公司;Reicheit-Jung2040切片机:德国。 组织前药剂量设计 选用清洁级健康雌性Wistar大鼠86只,随机分为3组:正常对照组12只、假手术组12只、卵巢切除组62只。所有大鼠适应性喂养1周后,将卵巢切除组大鼠以45mg/kg剂量的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,腹位固定,行卵巢切除术。假手术组只是切除小块脂肪组织,但不摘除卵巢。术后10周,将卵巢切除组大鼠随机分为:脾肾两虚模型组(12只)、己烯雌酚组(12只)、补肾组(12只)、健脾组(13只)及补肾健脾组(13只)。脾肾两虚模型组大鼠用大黄浓煎液灌胃,4m L/只,每日1次,连续14d;同时,其余各组大鼠胃饲等容积的蒸馏水。随后,己烯雌酚组、补肾组、健脾组及补肾健脾组大鼠分别给予己烯雌酚、补肾方药、健脾方药及补肾健脾方药,每日1次,连续6d,休息1d,再连续给药6d,每周称重1次,据此调整给药量;同时,脾肾两虚模型组大鼠给予200%的大黄浓煎液灌胃,每周2次。如此给药3个月。正常对照组、假手术组按同法灌服等体积的蒸馏水。处死前16d和前3d分别腹腔注射盐酸四环素30mg/kg体质量,以对骨进行荧光标记。给药结束后,取大鼠右侧胫骨近端1/3,制作不脱钙骨切片,进行骨组织形态计量学指标的检测。 2. 指标检测 2.1 组织嵌入法n-二甲基法 取大鼠右侧胫骨近端1/3,置于4%多聚甲醛溶液(p H值7.4)中固定24h,然后进行脱水,程序为80%乙醇2d,95%乙醇2d,100%乙醇2d,二甲苯2d。接着,标本依次在塑料聚合液Ⅰ液、Ⅱ液、Ⅲ液中各浸泡3d。以上固定、脱水和浸泡过程均在4℃进行。最后,将400μL N,N-二甲基对甲苯胺加入到100m L预冷(4℃)Ⅲ液中,用磁力搅拌器搅拌10min后,在青霉素小瓶中注入约7m L的Ⅲ液,将骨标本按同一方向放入瓶底,用注射器抽空包埋瓶中空气,然后置于-20℃冰箱中聚合1周左右,则可变为无色透明的坚硬包埋块。修块后,在Reicheit-Jung2