补肾健脾活血法对骨质疏松症大鼠骨骼、骨骼肌na.docxVIP

补肾健脾活血法对骨质疏松症大鼠骨骼、骨骼肌na 骨松收紧是一种以减少骨头数量、骨的微观结构为特征的。骨的脆弱增加了，容易发生全身骨折。目前,针对骨质疏松症的中医研究多是从“肾主骨”角度论述其发病机制,辨证以肾虚为主,多从补肾方法论治。但是从肌肉角度探讨发病机制的较少,而临床观察发现,因缺乏锻炼而肌肉发生退行性变化的老年人,也容易患有骨质疏松症。 本实验研究采用分子生物学实验方法,以骨质疏松症大鼠的骨骼、骨骼肌Na+-K+-ATP酶为研究核心,阐述骨质疏松症“骨肉不相亲”的病理机制,即骨骼肌收缩与骨骼协调性对骨质疏松症形成的影响。并且观察补肾方法、健脾方法、活血化瘀方法对骨质疏松症的防治效果和作用机制的异同。 rt-pcr检测检测骨髓细胞在体内的表达 1.动物SPF级Wistar大鼠120只,雌雄各半,雌性体质量(190±10)g,雄性体质量(240±10)g,3月龄。由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供,动物合格证号:SCXK(沪)2008-0016。 2.药品补肾中药由鹿茸冻干粉与淫羊藿提取物微粉及牡蛎纳米钙微粒混合即得。健脾中药为补中益气颗粒(北京汉典制药有限公司,批号:090101);活血中药为血府逐瘀胶囊(天津宏仁堂药业有限公司,批号:103015);阳性对照药为骨疏康颗粒(辽宁康辰药业有限公司,批号:080729)。造模用药:地塞米松磷酸钠注射液(郑州卓峰制药厂,批号:9031521)。 3.试剂Trizol(美国Invitrogen Life Techonlogies公司)、荧光定量PCR试剂盒(大连宝生物公司)、DNA Marker(大连Ta Ka Ra公司)。 4.仪器高速冷冻离心机(Sigma 3C15K美国)、Heidolph DIAX90型匀浆机(德国Heidolph)、Prism7500型PCR扩增仪(德国)、UV300核酸蛋白分析仪(英国,PYE-UNICAM/SPECTRONIC)。 5.分组按同性别大鼠体质量分层,随机数字表分为6组,每组20只,雌雄分笼饲养,每组分为A、B两笼,每笼10只。即为正常组、模型空白组(模型组)、补肾中药组(补肾组)、补中益气颗粒组(健脾组)、血府逐瘀胶囊组(活血组)和骨疏康颗粒组(骨疏康组)。 6.造模适应饲养1周后开始造模,除正常组外,各组大鼠肌注地塞米松,剂量为2.5mg/kg体质量,每周2次,连续9周。正常组大鼠常规喂养。 7.给药从造模第1天开始灌胃给药,每日1次。正常组、模型组给0.9%氯化钠溶液2m L;治疗组用药量按成人体公斤体质量(g/kg)的6.3倍计算(成人体质量按60kg计算),容积为1m L/100g体质量,补肾组给药量为鹿茸0.8g·kg-1·d-1,牡蛎0.263g·kg-1·d-1,淫羊藿0.0756g·kg-1·d-1;健脾组给药量为0.945g·kg-1·d-1;活血组给药量为0.504g·kg-1·d-1;骨疏康组给药量为2.1g·kg-1·d-1。实验期间,各组大鼠每周称重1次,并根据体质量变化调整给药剂量。 8.RT-PCR方法检测Na+-K+-ATP酶表达(1)参照Trizol说明书采取一步法提取总RNA。大鼠末次灌胃后,禁食24h,次日取材。所取骨组织、骨骼肌组织各取0.1g剪碎分别置于组织匀浆器中,加入Trizol 1m L,在冰浴中迅速匀浆15-30s,充分研碎组织,颠倒混匀后置于室温5min,然后后加入0.2m L氯仿,剧烈摇振15s,置于室温3min,以4℃、12 000r/min离心15min后,吸取上清液于另一个新EP管中,加入0.5m L异丙醇摇匀,室温置1h沉淀,再次离心,以4℃、12 000r/min离心15min后,以75%乙醇清洗1次,弃上清液,加无核酸酶的水20μL。采用紫外可见光分光光度计测定OD值。取1μL RNA样本,加79μL DEPC水,使RNA样品稀释80倍。用紫外分光光度计测OD260与OD280,用二者比值估计RNA的纯度,比值应该在1.8-2.0左右,提示样本中无蛋白剩余。RNA(μg/μL)浓度=OD260×40×80/1 000。(2)PCR反应:引物由Ta Ka Ra公司合成,其上下游引物序列分别5’-AAG GAC GCC TTT CAG AAT GCC-3’,5’-TGA CCA TGA TGA CCT TAA TCC-3’,扩增的基因片段长度为248bp,β-actin为内对照。其上下游引物序列分别为5’-CGT GCG TGA CAT TAA AGA G-3’,5’-TTG CCG ATA GTG ATG ACC T-3’扩增的基因片段长度为132bp。 9.统计学方法采用SPSS 10.0软件处理所得数据,选用One-way ANOVA进行统计分析,数据以x-±s