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肠道菌群的研究进展 人们的肠道就像一艘承担着巨大微生物的“航空母舰”，那里有许多种类和数量的微生物。有报道称, 人的肠道内定殖有400-500种不同的细菌。其细胞数量 (约1014) 是人体细胞数量 (约1013) 的10倍左右, 其中优势菌大多为厌氧菌。可培养的肠道菌大致分为:肠杆菌 (Enterobacteriaceae) 、肠球菌 (Enterococcus) 、葡萄球菌 (Staphylococcus) 、乳杆菌属 (Lactobacillus) 、双歧杆菌属 (Bifidobacterium) 、梭菌属 (Clostridium) 、拟杆菌属 (Bacteroides) 和酵母菌属 (Yeast)八大部分, 这些菌属对于庞大的肠道菌群而言, 仅仅是冰山一角。未被人们所熟知的肠道菌仍占总肠道菌群数的80%。从功能的角度, 肠道菌群的地位与作用几乎相当于一个后天获得的“器官”, 对人体健康和正常的生理代谢有重要作用, 如帮助人类消化食物、代谢药物及外源复合物、合成维生素、抑制病原体的侵袭、影响免疫机能的发育等。同时, 肠道菌群还为宿主基因水平上的功能多样性研究提供了方向。从进化的角度, 肠道菌群与宿主一同进化, 直接或间接参与人体的消化、营养吸收、能量供应、脂肪代谢、免疫调节、抗病等诸多方面。健康的宿主与健康的肠道菌群密不可分, 宿主在受肠道菌群影响的同时也会影响肠道菌群的结构与组成, 这些影响因素包括遗传因素、饮食差异、健康状态、环境因素等多个方面;相关报道还表明, 疾病和药物也会改变肠道菌群的结构和活性。由此可见, 这个繁冗的“肠道菌群大本营”亟待深入研究。 1 克服了传统方法的限制,增强了人们对微生物自然生物发展的认识。传统生物 许多经典方法在肠道菌群研究方面一直沿用, 如研究菌落特征、菌体形态、生理生化特征、代谢产物等指标, 这些传统方法主要是建立在纯培养技术之上的, 所以相对而言耗时、费力且操作复杂, 而且很大程度上受培养条件的制约, 这往往造成研究结果的不稳定性, 导致不能全面、客观地反映肠道菌群的真实情况。分子生物学技术的快速发展为肠道菌群研究提供了全新的方法和思维, 它克服了传统方法的限制, 使得科研工作者可以从基因水平估计出种的丰度和均匀度, 分清楚种的变异情况, 从而客观地认识微生物天然的生态状况。特别是宏基因组理论的提出以及与之相结合的技术逐步问世, 更提供了成套的基于非培养的微生物研究技术。1996年, Suan等利用不依赖于培养的分子生物学技术第一次较为全面地对人体粪便肠道菌群进行了研究, 显示只有24%的序列是前人已发现的肠道菌群, 而76%的序列属于亟待研究的未知菌, 这进一步说明了肠道菌群的多样性远远超乎人们的想象。经过长期的摸索和试验, 科研工作者们总结出了一系列适用于肠道菌群研究的分子生物学技术, 主要包括荧光原位杂交 (Fluorescence in situ hybridization, FISH) 、基于聚合酶链式反应的变性梯度凝胶电泳 (Polymerase chain reaction denaturing gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE) 技术、实时荧光定量PCR (Real-time polymerase chain reaction) 技术、基因芯片 (Gene chip) 技术及测序技术等。 1.1 fish的应用 荧光原位杂交技术是20世纪80年代在核酸分子杂交基础上发展起来的一门技术, 1989年Delong等首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。经过多年的逐步发展和完善, 形成了现在的FISH技术。它是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示DNA序列位置的方法。该方法根据目标微生物16S r RNA基因序列的相对保守区域设计寡聚核苷酸探针, 利用荧光素进行标记, 与靶细菌杂交, 通过检测目标序列来确定微生物的种类、数量及空间分布。2002年Swidsnski A.等利用FISH技术研究了肠炎患者的肠粘膜菌群, 发现随着病人疾病程度的加重, 其肠粘膜上的菌群密度也增大。同年, Kaouther B.A.等利用FISH技术对人类粪便中难于培养的卵胃球菌样细菌 (Rum inococcusobeumlikebacteria) 进行了鉴定和计数, 发现此类细菌是人类粪便中极其重要的组成部分。2004年, Matsuki等应用FISH技术对6名健康志愿者肠道内的6大优势菌群进行了研究, 结果显示球形梭菌 (Clostridia coccoides) 的含量为10.4 log CFU/g, 柔嫩梭菌 (Clostridia leptum) 为10.1 log CFU/g, 脆弱拟杆菌 (Ba