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荧光原位杂交fish检测her2基因状态的研究 17q12-21.32的人类表皮生长因子受体2基因。对于h-2、h-neu或c-erbb-2，编码了跨膜酪氨酸激酶受体。受体蛋白质与h家族及其配体之间的相互作用，通过细胞间的信号传达调节细胞的生长、生存、分化和生长。研究表明,大约25%~30%的浸润性乳腺癌和80%乳腺导管内癌患者有HER2基因扩增或蛋白过表达,而这些患者可能预后不佳、激素治疗和常规化疗反应差,但却是曲妥珠单抗(trastuzumab或Herceptin)治疗的靶点人群。因此准确地检测HER2状态是有效治疗乳腺癌的前提。 目前美国食品及药物管理局(FDA)批准用于HER2检测的方法有2种:即检测HER2蛋白的免疫组织化学(IHC)法和检测HER2基因的荧光原位杂交(FISH)法。因IHC和FISH实验方法自身的固有特点,导致IHC检测HER2表达(2+)与FISH检测HER2基因状态结果之间的一致性较差,而IHC(3+)也并非代表HER2基因扩增,IHC检测HER2蛋白表达阳性患者的预后以及对药物治疗的反应也存在着明显的差异,因此选择并使用准确可靠的检测方法非常重要。我们介绍FISH检测HER2基因状态的方法及结果判读标准,并选择HER2蛋白IHC结果分别为阴性(-),阳性(1+)、(2+)和(3+)的乳腺癌石蜡标本,以FISH方法检测其HER2基因状态,分析两种方法所得结果的一致性,探讨目前争论最多的IHC(2+)和(3+)与FISH检测结果的一致性,以期为临床选择准确有效的HER2诊断手段提供可靠的依据。 分子检测方法ph 1.组织标本:从北京协和医院病理科2000—2005年乳腺癌石蜡包埋组织库档案中,按抽签方式随机选择经IHC法检测过HER2蛋白表达的女性乳腺癌组织标本28例(除例4为浸润性导管癌+浸润性微乳头状癌,例22为乳腺浸润性导管癌+导管内癌外均为浸润性导管癌),IHC(3+)12例(例1~12)、(2+)10例(例13~22)、(1+)3例(例23~25),(-)3例(例26~28)。连续切4 μm切片2张,1张用于HE染色,另一张未染色的切片用于FISH分析。 2.IHC检测用HercepTestTM试剂盒(购自Dako Cytomation公司,Code No.K5240),EnVision法。 3.FISH检测:(1)试剂与探针:石蜡预处理Ⅱ试剂盒,其中主要含有的预处理溶液和蛋白酶缓冲液、PathVysionTMHER-2 探针试剂盒、橡胶水泥均购自Vysis公司。(2)标本处理:石蜡切片于56℃烤片过夜。常规脱蜡,即将玻片置于二甲苯中3次,每次10 min, 100%乙醇中3次,每次10 min。在预处理溶液中,80℃处理10 min,再于蛋白酶溶液中消化15 min,依次经70%、85%和90%的乙醇脱水后,自然干燥。(3)FISH:取10 μl探针混合液滴于经过上述处理的组织标本上,盖上盖玻片,橡胶水泥封片。将标本放在杂交仪中,73℃变性5 min后,37℃杂交过夜。次日取出标本,去掉橡胶水泥,在洗脱液(2×SSC/0.3%NP40)中,73℃洗涤2 min,再于室温下在洗脱液中洗涤5 s,自然干燥。二脒基苯基吲哚(DAPI)对比染色,在荧光显微镜下,通过特异的滤光片分别观察细胞中显示不同颜色的信号,通过VideoTest软件进行图像合成。 4.结果判读标准:(1)IHC:按照Dako公司提供的分级进行结果判读。即全部瘤细胞中细胞膜均无染色或10%瘤细胞膜染色者结果为0;瘤细胞10%细胞膜不完整弱染色者结果为(1+);瘤细胞10%细胞膜轻度至中度完整染色者结果为(2+);瘤细胞10%细胞膜完整强染色者结果为(3+)。(2)FISH:首先在HE染色切片上确认癌细胞区域,然后在10倍物镜下,于FISH标本上找到HE的同一视野,再仔细观察信号。其过程为:在40倍物镜下扫描整张标本,观察是否存在HER2表达的异质性以及标本的质量。满意的标本应是75%以上癌细胞核中都有杂交信号,然后于100倍物镜下,通过特异的单通道滤光片观察癌细胞核的FISH结果并进行信号计数和cut-off值计算。PathVysionTM的探针试剂盒中混合了2种DNA探针,一是标记为绿色荧光的17号染色体着丝粒,另一是标记为橙红色荧光的HER2基因,而细胞由DAPI染成了蓝色。在观察癌细胞并进行信号计数时,应选择细胞核大小一致、核的边界完整、DAPI染色均一、细胞核孤立无重叠、绿色着丝粒信号清晰,并且一般为2个或以上信号点的细胞,随机计数20~30个癌细胞核中的双色信号,红色信号的总数与绿色信号的总数比值≥2时,即为HER2基因扩增,否则为无扩增;若两种信号的比值20或众多信号连接成簇时,可不用计算,即视为基因扩增;若比