荧光原位杂交fish技术在染色体研究中的应用.docxVIP

荧光原位杂交fish技术在染色体研究中的应用 1848年，hofmet观察到了节头虱（transport）细胞的消失以及球形体的出现。1888年，wadarry将球形体称为染色体。1915年Morgan确认基因位于染色体上, 染色体在细胞周期的不同时期凝集程度不同, 间期时转变为染色质遍布于核内, 而到有丝分裂时染色质通过螺旋折叠压缩近万倍包装成大小不等、形态各异的短棒状的染色体。自1906年Morgan确定了基因在染色体上呈直线排列并通过细胞分裂转给后代以来, 人们便开始了染色体行为与生物性状关系以及基因在染色体上分布的深入研究。而荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH) 技术是目前进行染色体研究的最主要的方法之一。笔者主要简述基因在染色体上定位及其荧光原位杂交技术的应用和发展。 1 荧光原位杂交技术 荧光原位杂交技术是在同位素原位杂交技术的基础上发展起来的, 而同位素原位杂交是以原位杂交技术为基础建立起来的。原位杂交 (in situ hybridization) 是根据两条单链核酸分子在一定条件下同源互补碱基顺序会产生分子杂交的原理, 利用标记的已知核酸探针, 在组织细胞及染色体上检测相应的DNA或RNA序列的一种技术。该技术是从20世纪70年代逐步发展起来的, 它具有特异性强、灵敏度高、定位准确等优点。1969年Gallt等人首先在细胞制片标本上利用放射性同位素标记的探针, 通过DNA、RNA的杂交, 使特定的DNA或RNA序列在细胞染色体上显示出来, 开创了原位杂交技术。1977年Rudkin等发明了用间接免疫荧光法检测目的DNA的非同位素原位杂交技术。1981年Langer等首次成功地采用生物素标记的核酸探针进行染色体原位杂交, 使以荧光标记为主的原位杂交技术开始起步并不断发展起来。先期的基因原位杂交技术多用于基因组中重复顺序的定位, Gerhard等于1981年成功地将人单拷贝α球蛋白DNA序列定到16号染色体上后, 原位杂交技术也越来越多地应用于非重复顺序基因定位的研究, 开始了荧光原位杂交技术。荧光原位杂交技术 (FISH) 是于20世纪末在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。其基本原理仍是用已知的标记单链核酸为探针, 按照碱基互补的原则, 与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合, 形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列, 因而可用探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因定位在染色体上。荧光原位杂交技术与其他原位杂交技术相比具有不需要放射性同位素、实验周期短、非特异杂交信号污染少、标记的探针稳定、检测简便快速、灵敏度高和安全等优点。尤其是荧光信号可以被特定的相机或激光扫描显微镜检测并记录下来, 通过数字成相显微技术可以获得更为准确的图像。不但能显示中期分裂相, 还能显示间期核。 2 探针片段大小的影响 在荧光原位杂交中, 探针的标记和片段大小是FISH流程中较关键的环节。不同类型的DNA需用不同的标记方法, 但对探针片段大小的要求基本是一致的, 即一般为200~600 bp。这样不但会提高杂交效率, 而且会降低非特异性标记, 如果片段太短, 特异信号的强度和频率就会降低, 而如果片段太长, 不但会削弱特异信号, 而且会显著提高背景信号的频率, 而且在这2种极端的情况下, 背景信号均较亮, 以致会与特异信号混淆而难以区分。探针类型主要有以下几种: 2.1 进化的保守性 人类和哺乳类基因组内都有一些高频率的重复序列, 在进化上很少具有保守性。如果以基因组为探针, 这些存在于靶序列和探针之间的高度重复序列会首先退火, 超过那些单一和保守的序列, 因而杂交表现出种的特异性。 2.2 靶位点和前周出布前前细胞检测 类似于α卫星、卫星Ⅲ类的探针杂交靶位点常常大于1 Mb, 与靶位点结合紧密, 杂交信号强, 易于检测, 常用于检测间期细胞非整倍和微小标志染色体。 2.3 探针的制备 由一条染色体或其上某一区域极端不同核酸片段组成, 可由克隆到噬菌体或粘质粒的染色体特征性大片段插入文库制取, 切微切文库探针片段小, 与邻近区域发生重叠或制片中被破坏的可能性小。可用于中期染色体重组和间期核结构分析。 2.4 柯斯质粒标记 单拷贝序列探针是分子遗传学研究中常用的探针类型。由于这类探针一般只有1~2 kb。通常是某个基因的DNA克隆、RFLP或RAPD标记或是用大插入片段探针, 如柯斯质粒或酵母人工染色体标记。这些序列可以来自白质粒 (plasmid) 、粘粒 (cosmid) 、噬菌体P1载体 (bacteriophage P1) 、细菌人工染色体 (BAC) 或酵母人工染色体 (YAC) 克隆等,