高效液相色谱法测定连钱草中熊果酸和齐墩果酸.docxVIP

高效液相色谱法测定连钱草中熊果酸和齐墩果酸 连草是嘴唇科植物的活血丹干燥部位。具有润水通淋、清热解毒、祛瘀消肿的功效。对于连钱草的质量控制, 《中华人民共和国药典》 (2010年版) 主要通过木犀草素的薄层色谱来鉴别真伪, 通过测定醇溶性浸出物的含量来控制药材质量, 并未见具体化学成分的含量测定。三萜酸类为连钱草主要有效成分, 其中熊果酸具有抑制血管生成、抗肿瘤、抗炎等作用;齐墩果酸具有保肝、消炎、降糖等作用。本文以熊果酸和齐墩果酸为指标, 采用高效液相色谱法同时测定二者的含量, 为该药材的质量控制提供实验依据。 1 药品、试剂与仪器 岛津LC-10A型高效液相色谱仪。熊果酸对照品 (含量测定用, 批号:110742-200212) , 齐墩果酸对照品 (含量测定用, 批号:110709-200505) , 均购自中国药品生物制品检定所;甲醇为色谱纯, 水为纯化水, 其他试剂均为分析纯。连钱草药材来源于河南、湖北、江苏等地, 经鉴定均为唇形科植物活血丹的干燥地上部分。 2 方法和结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 无水乙醇溶液 熊果酸、齐墩果酸对照品干燥至恒重, 分别精密称取5.45 mg、2.19 mg, 置于10 ml容量瓶中, 加入无水乙醇溶解并稀释至刻度, 摇匀即得。对照品溶液中熊果酸浓度为0.545 mg/ml, 齐墩果酸浓度为0.219 mg/ml。 2.1.2 供试品溶液的制备 取连钱草样品约2.0 g, 置于平底烧瓶中, 加入甲醇25 ml密塞称重, 加热回流提取30 min放冷, 称定后以甲醇补足减失的重量, 摇匀后滤过, 弃去初滤液, 取续滤液12.5 ml蒸干, 残渣加无水乙醇-氯仿 (3:2) 混合液溶解并定容至10 ml量瓶中, 摇匀, 微孔滤膜 (0.45μm) 过滤, 滤液作为供试品溶液。 2.2 流动相、流速 色谱柱:大连依利特C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm, 5μm) ;流动相:甲醇-0.05 m磷酸二氢钠溶液 (87:13) ;流速:1.0 ml/min;检测波长210 nm。理论塔板数以熊果酸和齐墩果酸峰计均不低于4000。 2.3 标准曲线的绘制 准确吸取对照品溶液1、2、4、6、8、10μl, 分别注入高效液相色谱仪, 以色谱峰面积 (μV·s) 为纵坐标 (Y轴) , 以进样量 (μg) 为横坐标 (X轴) , 进行线性拟合并绘制标准曲线。熊果酸的回归线性方程为Y=366131 X-9288r=0.9993;齐墩果酸的回归线性方程为Y=428589 X-50454, r=0.9996。结果表明:熊果酸进样量在0.55~5.45μg, 齐墩果酸进样量在0.22~2.19μg范围内线性关系良好。 2.4 计算各峰面积的rsd 准确吸取对照品溶液8μl, 重复进样测定5次, 计算各峰面积的RSD。熊果酸峰面积的RSD为1.92%, 齐墩果酸峰面积的RSD为2.51%, 结果表明仪器精密度良好。 2.6 重复性试验结果 取同一批连钱草样品, 共5份, 制备供试品溶液, 进样测定, 外标法计算熊果酸和齐墩果酸的含量, 结果二者的RSD分别为2.09%和2.60%, 表明样品制备方法重复性良好。 2.7 加样回收和加样回收试验 取同一批已知含量连钱草样品, 共6份, 每份约1.0 g, 分别加入适量的对照品, 制备供试品溶液, 测定含量并计算回收率。结果熊果酸的平均加样回收率为98.32%, RSD为1.74%;齐墩果酸的平均加样回收率为99.86%, RSD为1.84%。 2.8 外标法计算熊品种和齐墩以酯类品种的含量 取不同产地连钱草样品, 制备供试品溶液, 分别精密吸取对照品溶液4μl、样品溶液15μl, 注入高效液相色谱仪, 外标法计算熊果酸和齐墩果酸的含量。结果见表1。 3 标准曲线及峰面积法确定 同一产地连钱草样品中, 熊果酸的含量远高于齐墩果酸;不同产地连钱草中, 熊果酸和齐墩果酸的含量存在较大差异, 同一省份含量略接近。结果表明连钱草药材的质量与生长环境、栽培方法、采集时间及存放时间等因素关系密切。 准确吸取供试品溶液15μl, 分别于0、3、6、9、12 h进样, 计算各峰面积的RSD。熊果酸峰面积的RSD为1.74%;齐墩果酸峰面积的RSD为2.13%, 结果表明所测组分在12 h内稳定性良好。 2.5 稳定性试验