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利用纤维素诱导的草鱼纤维维素酶的研究 纤维素酶的研究始于20世纪50年代。它最初的目的是防止棉花、木材和纸张的腐烂。随着人口的增加和资源的消耗，可再生资源的开发和利用已成为一个共同关注的问题。在植物光合作用的产物中，纤维占很大比例。然而，为了避免污染碳氢化合物和丝绸，寻找有效的纤维素酶是一个重要的问题。它的解决对人类具有不可预测的效果。蘑菇又名马鞭草和杆菌，属于真菌科，在中国南方非常有名。它具有很高的营养价值。它是世界上第五大重要的经济栽培品种。蘑菇主要生长在草质纤维中，草质纤维中含有大量的维生素。因此，蘑菇中必须包含完整的纤维素酶系统。本文主要解释了纤维素及其诱导和分布，并对其酶系进行了初步定性。 1 材料和方法 1.1 pcep-nitrophonyl--d-glucopyla-hyrace,p-hyrachide,p-hyrachide,p-sf 主要试剂购于美国SIGMA公司,包括:木聚糖(xylan,from birchwood),果胶,p-nitrophonyl-β-D-cellobiose (pNPC),p-nitrophonyl-α-D-glucopyranoside (pNPG),p-hydroxybenzoic acid hydrazide (PAHBAH),phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF);羧甲基纤维素(CMC),购自中国医药集团上海化学试剂公司. UV-2000型分光光度计(UNICO),IEC multiry 高速冷冻离心机(Thermo IEC). 1.2 培养基和培养基 草菇(Volvariella Volvacea)菌种由南京师范大学何强泰先生惠赠. 种子培养基: 蔗糖 20 g/L,KH2PO40.6 g/L,MgSO40.5 g/L, VB10.5 mg/L,琼脂20 g/L. 摇瓶培养基:各种不同的碳源10 g/L,KH2PO40.6 g/L, MgSO40.5 g/L, VB10.5 mg/L. 1.3 蘑菇的生长和粗酶的制备 种子在37 ℃静止培养4～5 d,摇瓶培养基在37 ℃以200 r/min的转速培养4～5 d. 1.3.1 胞外酶液的制备 将草菇的摇瓶培养液用尼龙布过滤,取滤液,在4 ℃以9600 r/min离心10 min,取上清液,用80%饱和度的硫酸铵在4 ℃沉淀并平衡2 h,在4 ℃以9600 r/min离心10 min,取沉淀,用适量的pH 6.5的MOPS溶解,所得的溶液即胞外酶液. 1.3.2 mops胞内酶液的制备 将草菇的摇瓶培养液用尼龙布过滤,取菌丝体,用25 mmol/L pH 6.5的MOPS洗3遍后,将菌丝体于4 ℃用匀浆器匀浆10 min,加入适量的pH 6.5的MOPS得到匀浆液,在4 ℃以9600 r/min离心10 min,取上清液,即得到胞内酶液. 1.4 酶活性测定 1.4.1 ops-pahbah法 取100 μL质量分数1%的CMC溶液,加80 μL 25 mmol/L pH 6.5的 MOPS,加20 μL酶液,50 ℃温度条件下反应30 min,加600 μL终止剂/显色剂PAHBAH(配方为:4体积单位的0.5 mol/L NaOH与1体积单位的溶于0.5 mol/L HCl的5% PAHBAH混合),于100 ℃ 水浴10 min,冷却后测A410值. 1.4.2 活性物质的碳酸钠s110 200 μL 2.5 mmol/L的pNPC溶液,加200 μL缓冲液,加100 μL酶液,于50 ℃反应30 min,用500 μL 1 mol/L的碳酸钠终止反应,测A410值.详见文献. 1.4.3 活性物质的碳酸钠s110 200 μL 2.5 mmol/L的pNPG溶液,加200 μL缓冲液,加100 μL 酶液,于50 ℃反应10 min,用500 μL 1 mol/L的碳酸钠终止反应,测A410值.详见文献. 1.4.4 酶单位1的定义 在上述反应条件下,1 min内催化产生1 μmol产物所需的酶量. 1.5 酶性质分析 1.5.1 最合适反应温度的测量1 在20～80 ℃范围内,每隔5 ℃,分别测定酶活,以酶活最高为100%计算相对酶活. 1.5.2 邻苯二甲酸氢钾缓冲液和磷酸缓冲液的合成 在不同的pH条件下分别测定酶活,以酶活最高为100%计算相对活性.在pH 3.8～6.2 范围内缓冲液是50 mmol/L的邻苯二甲酸氢钾缓冲液,在pH 5.8～8.0 范围内缓冲液是50 mmol/L的磷酸缓冲液. 1.5.3 温度值的测定 在相对稳定的pH下,使酶在某个温度下保温不同的时间,再测定相对酶活,以未保温(4 ℃保存)的酶样活性为100%,确定酶的半衰期为1 h的温度值. 1.5.