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重组人胰岛素原6-arg-arg-人胰岛素原的发酵及下游纯化工艺的优化 目前，ri有三种国际药物重组（ri）的方法。 1)用基因工程大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)分别发酵生产人胰岛素(human insulin, hI)的A、B链,然后经化学再氧化法,使两条链在一定条件下重新形成二硫键,得到hI。这一方法缺点较多,目前已较少使用; 2)用基因工程E.coli发酵生产人胰岛素原(human proinsulin, hPI),后经加工形成hI。E.coli系统表达量高,但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白,产物易降解,故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后,表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hI; 3)通过基因工程酵母菌发酵生产hPI,经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单,但缺点是生产慢,生产周期长,且重组蛋白分泌量少(1～50 mg/L),产量低。因此,虽然rhI投放市场已久,但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略,尤其是对E.coli表达系统的研究更是越来越深入,用E.coli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面,在胰岛素的基因工程生产中,下游处理非常复杂,复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量,简化下游处理过程等方面进行探索,建立了一套经过优化的高效完整的基因工程E.coli发酵表达(His)6-Arg-Arg-人胰岛素原,后加工成hI的制备工艺。 1 实验部分 1.1 病毒 RRhPI/pQE-40E.coliM15菌株,按文献的方法构建。 1.2 其它试剂和仪器 DEAE-Sepharose FF (琼脂糖快流速阴离子交换剂)为杭州争光树脂有限公司产品,SephadexG-25为Sigma公司产品,Superdex75为GE公司产品,溶菌酶、脱氧核糖核酸酶、胰蛋白酶和羧肽酶B均为Sigma公司产品,谷胱甘肽[氧化型(GSSG)和还原型(GSH)为上海博奥生物科技有限公司产品,二硫苏糖醇(DTT)为Organics Inc.产品,β-巯基乙醇和异丙基-β-D-巯基吡喃半乳糖苷(IPTG)为BBI分装,其它试剂均为国产或进口分析纯。 1.3 -4-4-4-4重组菌体的制备 参照文献,采用二级发酵的方式,用正交法优化培养条件,并将优化条件用于发酵罐进行发酵,收获湿菌体。 RRhPI/pQE-40E.coliM15的发酵罐培养:将10 ml 经过活化的RRhPI/ pQE-40E.coliM15转移至100 ml培养基中进行培养,培养一段时间后,将其转移至含有1.5 L培养基的发酵罐中,培养一段时间(转速为300 r/min,通气量为1∶1.5～1∶1.8), 过程中加入一定量新鲜的培养基并用NaOH调节pH,之后加入IPTG并升温诱导RRhPI的表达,转速随即调为400～500 r/min,增大通气量至1∶1.8～1∶2.0,继续培养一段时间后,收集菌体。 1.4 上清液和沉淀 将收集的湿菌体冻存于-20 ℃,然后悬浮于缓冲液A(50 mmol/L Tris-HCl, 0.5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L NaCl, 5%甘油,0.1～0.5 mmol/LDTT,pH7.9)(5～6 ml/g湿菌)中,加入溶菌酶(5 mg/g湿菌体),室温或37℃振荡2 h。冰浴超声10 s×30 次,其间每次间隔20 s,功率为200 W。10 ℃条件下1000 g离心5 min去除细胞碎片。上清液中的包涵体(Inclusion body,IB)在4 ℃条件下27000 g离心15 min收集,然后用含2 mol/L尿素的缓冲液A充分悬浮,室温静置30 min后4 ℃条件下17000 g离心15 min,收集沉淀。沉淀再用含2%脱氧胆酸钠的缓冲液A充分悬浮,4 ℃条件下17000 g离心15 min,收集沉淀。最后沉淀用10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.3洗涤两次(4℃,17000 g离心15 min )。 1.5 洗脱溶液的制备 参照文献,将收集的IB用含有0.1%～0.3%β-巯基乙醇的缓冲液B(30 mmol/L Tris-HCl,8 mol/L尿素,pH 8.0)溶解,上于已用缓冲液B平衡的DEAE-Sepharose FF柱,用合适的氯化钠梯度洗脱,收集含RRhPI的洗脱液。 1.6 gly-naoh重组蛋白的制备 将初步纯化后的RRhPI通过Sephadex G-25脱尿素,转换缓冲液为不同pH的50 mmol/L Gly-NaOH重组液,或含有适量GSSG的Gly-NaOH缓冲液中,使蛋白终浓度为0.1～0.6 mg/ml,收集趋于正确折叠的RRhPI单体组