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红花中羟基红花黄色素a提取工艺的优化及其热稳定性考察 红花是蔷薇科植物的红花。它具有活血、通经、抗瘀、镇痛的功效。这是传统的活血化瘀药。中医认为红花味辛,微苦,性温,归心,肝经,是活血通络,去瘀止痛之良药,为传统而又珍贵的中药。现代药理研究表明它对心血管系统有广泛而显著的作用,其中羟基红花黄色素A (Assafflor yellow A),属于黄酮类化合物,为红花中活血化瘀作用的主要有效成分。本研究采用单因素和正交实验方法,对红花药材的提取方法,及提取条件进行了考察,得出最佳提取条件,同时又对羟基红花黄色素A热稳定性进行了考察。 1 仪器、试药与仪器 药物分析紫外分光光度测定仪(SHIMADZU UV-1700);DIONNEX高效液相色谱仪(P680 HPLC Pump;ASI-100 Automated Sample Injector;UVD170U;Ther-mostatted Column Compartment TCC-100);电子分析天平(SGHANGPING FA1104);流动相所用乙腈(色谱纯)、水(重蒸水);其余试剂为分析纯;红花,购于成都五块石药材市场。经江西中医学院生药教研室鉴定,符合《中国药典》2005年版一部红花项下的相关规定。羟基红花黄色素A对照品为中国药品生物制品检定所提供(批号111637-200301),供含量测定用,使用前置硅胶干燥器中干燥至恒重。 2 提取方法和结果 2.1 黄色素a-羟色胺测试 2.1.1 条件1 2.1.2 对照溶液的制备 2.1.3 试验溶液的制备 2.1.4 方法的重现性及回收率试验 (2)精密度考察。精密吸取羟基红花黄色素A对照品溶液重复进样测定6次,结果RSD为0.06%,表明方法精密度良好。 (3)重现性试验。取样品6份,按样品溶液制备后,取5μl进样,测定并计算每份供试品中羟基红花黄色素A的含量。结果表明,RSD为0.78%,方法重现性好。 (4)加样回收率试验。精密称取已知羟基红花黄色素A含量的样品6份,精密加入羟基红花黄色素A对照品溶液2 ml,按样品测定项下操作,得平均回收率为99.8%,RSD=1.3%。 2.1.5 试验对象的测量 2.2 提取工艺与影响因素的研究 2.2.1 提取方法的验证 2.2.2 考察渗透时间 2.2.3 溶解溶液的研究 2.2.4 干预时间的研究 2.2.5 羟基金银花黄色素a的提取 由上表可知,通过冷浸法,冷浸药材12 h,羟基红花黄色素A的含量已达到平衡,溶媒为20倍时,羟基红花黄色素A的提取率最高,提取两次已经基本提取完全。 2.2.6 羟基金银花黄色素最佳提取工艺的确定 试验时,取10 g红花粉末,按表2进行正交试验,测定吸光度值,计算羟基红花黄色素A提取率。结果如表3所示。表4为正交试验方差分析表。 由表3,4的结果可以看出,三因素对提取效果影响的大小顺序是:BAC,即浸取时间对羟基红花黄色素A提取率的影响最大且三因素影响显著(P0.05 )。 根据直观分析和方差分析的结果,确立红花黄色素的最佳提取工艺为A2B2C2,即红花药材,分别加20倍量的水提取2次,在40 ℃下,2次浸取时间分别为12 h和4 h,过滤,合并滤液。正交试验结果与单因素条件下的实验结果相吻合。 2.2.7 提取工艺的验证 3 羟基红豆黄色素a的热稳定性 由光谱图可知,羟基红花黄色素A水溶液在401 nm处吸收较强。说明在401 nm波长下,测定水溶液中的羟基红花黄色素A含量最为可靠。 羟基红花黄色素A不稳定,遇热易分解。配制0.01 mg/ml羟基红花黄色素A水溶液,于不同温度下保温不同时间,考察羟基红花黄色素A的热稳定性(以保存率表示)。根据公式保存率R% =At/A0×100%(A0为羟基红花黄色素A溶液开始t=0时吸光度,At为羟基红花黄色素A溶液经过t分钟的吸光度),计算各自保存率。 由表2实验结果可知:在100℃加热60 min,羟基红花黄色素A的保存率为85.8%,下降15%; 20℃放置60 min羟基红花黄色素A的保存率为99.7%,基本保持不变。这些结果说明,随温度升高和加热时间的延长,羟基红花黄色素A发生了热降解,保存率也随着下降。因此羟基红花黄色素A不易在高温条件下提取或保存,在低温下具有一定的稳定性。 3 羟基金银花黄色素a含量测定 (1)在研究红花的提取工艺时,参考了大量的文献,由于羟基红花黄色素A是水溶性的物质,考虑到经济节约,污染小的因素,直接考察的用水作溶媒,没有考察其他溶媒的提取效果的比较。 (2)目前关于红花中羟基红花黄色素A的含量测定方法主要有化学法,分光光度法和薄层层析法。化学法只能作为一种定性方法,不能用于红花的质量考察;分光光度法是测定药材中总黄色素和总红色素;薄层层析法因各种因素的影响误差