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铜藻精子发生与幼苗生长的研究 大型海域是海洋牧场的重要成员之一，主要是棕榈树。马尾藻属是褐藻门中最大的一个属,目前已确定的种类超过了400种,该属中的许多种类是海藻场的重要成员。 铜藻(Sargassum horneri)是浙江嵊泗枸杞岛潮下带马尾藻群落的绝对优势种,生物量占90%以上,其生物量的变动会对枸杞岛海域的限制性营养盐(硝酸盐)波动产生影响。随着陆地经济的发展,对海洋的污染不断加剧,大型海藻的生境受到破坏,许多海藻的资源量也下降,因此,寻找有效的繁育方式,开展海藻增殖尤为迫切。 铜藻属雌、雄异株的大型海藻,通过人工培育,利用有性生殖获得苗种进行人工移栽,是增加该藻资源量的一条有效途径。所以,阐明该藻受精卵的发生、幼苗发育过程以及适宜的人工培育条件,对开展它的人工苗种繁殖和海区增殖十分重要。国内外学者曾对铜藻的生物学特征、生活史、生态条件对生殖托的形成与成熟、配子放散与受精、幼孢子体附着与生长等进行了较深入研究[3,8,9,10,11,12,13,14,15],但对铜藻由受精卵发育至幼孢子体的整个过程还缺乏系统观察。 本实验旨在通过室内人工培养,观察铜藻受精卵的发生及幼孢子体的发育,探明其幼孢子体的形态建成及早期发育的适宜条件,为今后开展全人工育苗提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 探索维护枸杞岛海域 本实验用的铜藻成藻分别于2010年5-6月和2011年6-7月采自浙江省嵊泗县枸杞岛海域(122°46′E,30°43′N)。采集到的鲜藻用海水浸泡过的湿毛巾和湿报纸包裹后,放入保温箱内,在24 h内运回实验室内进行培养。 1.2 红酵母原螯虾卵的制备 采集的成藻运抵实验室后,整株放入大型培养缸内进行充气培养,并剪取具有雌雄生殖托的侧枝,在灭菌海水中用毛笔反复刷洗其表面以清除附着生物,然后再剪下生殖托小枝,按照1∶1的雌雄比例混合,充气培养在培养瓶(1 L)内,以获取受精卵。暂养用的培养液为添加0.5×10-6KI的MES培养液,温度18℃,光密度60~90μmol photons/(m2·s),光照周期14L∶10D,每天更换一次培养液。 1.3 受精织物的形态观察 由于铜藻的受精卵具有显著的“挂托分裂”现象,雌性生殖托的表面具有一层粘液,能把受精卵牢牢粘住,待受精卵发育成具有假根芽,能附着的幼孢子体时才脱落,离开母体生活,所以为了观察卵的受精和受精卵的早期发育,用双面刀片把附着在生殖托上面的卵或受精卵刮下来,置于培养皿(Ф=9 cm)内培养,用尼康显微镜(Eclispe 90i)进行形态观察、拍照和测量大小。培养条件:温度18℃,光密度40μmol photons/(m2·s),光照周期14L∶10D。 1.4 幼孢子体的培养 待幼孢子体自然从生殖托表面脱落后,将雌、雄生殖托从培养瓶中移去,收集沉底的幼孢子体,并用消毒海水冲洗数次后,把它们充气培养在添加0.5×10-6KI的MES培养液中,每天随机取30个幼孢子体,进行拍照和生长测量。培养条件同受精卵的收集与培育。 1.5 幼苗生长和生长特性的测定 把受精后约48 h、已分裂成多细胞或已具假根芽的幼孢子体刮下后,把它们置于培养皿中(Ф=9cm),分别培养在15、18和21℃下,光密度均为40μmol photons/(m2·s),光照周期为14L∶10 D,定时随机取30个视野(10倍)统计它们的存活率和伸长率。 幼孢子体被培养至第15天,挑选长度相近、形态相似的幼苗,每30株幼苗为一组,用于研究温度及光周期对幼苗生长的影响。每隔5天测量一次幼苗的长度和叶片数,相对生长率根据下列公式计算:RGR(%/d)=100×[Ln(Lt/L0)]/t。 培养温度试验:温度分15、18、21、24和27℃5组,光密度为40μmol photons/(m2·s),光照周期为14L∶10D,充气培养并每5天更换一次培养液。 光照周期试验:光周期分短光照(10L∶14D)和长光照(14L∶10D)二种,其它培养条件:温度18℃,光密度40μmol photons/(m2·s),充气培养并每5天更换一次培养液。 2 结果 2.1 生殖托发育的仿真 从海区采回的铜藻成藻,主枝明显,侧枝较多侧枝又再分出大量小枝,在小枝上已具有肉眼可辨的雌、雄生殖托(图版Ⅰ-1,2)。雌性生殖托较短粗,长度为14.3~26.0 mm(图版Ⅰ-3,5),而雄性生殖托较细长,长度为12.3~72.0 mm(图版Ⅰ-4,6)。每年的5-6月为铜藻的繁殖盛期,采回的成藻在带回实验室途中可能由于受温差和干露等刺激,雌性生殖托很容易释放卵子。 雌性生殖托从基部至头部逐渐成熟,采集到的样本通常是基部和中部的成熟度比头部高,基部和中部的生殖窝孔径比头部的大许多(图版Ⅱ-1)纵切面结果发现基部和中部的卵子直径远远大于头