miR-888和miR-891a的双重微滴式数字PCR检测在精液鉴定中的应用.docxVIP

? ? miR-888和miR-891a的双重微滴式数字PCR检测在精液鉴定中的应用 ? ? 魏孙祥，陈惠香，胡胜，赵一霞，石慧霞，王哲，李文，季安全，孙启凡 1.山西医科大学法医学院，山西 太原 030001；2.公安部鉴定中心 现场物证溯源技术国家工程实验室法医遗传学公安部重点实验室，北京 100038 确定案发现场遗留的体液斑迹组织属性对于推断案件性质、重建犯罪现场等具有重要意义[1-2]，其中精液（斑）是法医物证鉴定中常见的生物物证，尤其对于强奸、猥亵案件至关重要。 微小RNA（microRNA，miRNA）是一种长度为18～24 个碱基的非编码RNA，具有高稳定性、强保守性、良好的组织特异性、可兼容DNA 同步分析等优势，是法医学体液鉴定的重要工具[3-8]。微滴式数字聚合酶链反应（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）是一种高灵敏度、高精确性的定量方法，对于低浓度核酸分子检测结果的可重复性好，可用于miRNA 的绝对定量检测[9-10]。研究[5-6]结果表明，miR-888 和miR-891a 具有良好的精液特异性，可通过对其表达量的检测进行精液鉴定，但目前使用的检测方法均为实时荧光定量反转录聚合酶链反应（real time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR）相对定量法，使用不同的内参基因可能会对检测结果作出不同的解释[11]，受抑制剂、检测平台和扩增效率影响较大，对结果的解释不够直接和客观[12]。 本研究旨在建立可同时检测miR-888和miR-891a的双重ddPCR 检测体系，通过绝对定量对miR-888 和miR-891a 作为精液特异性标记的可靠性进行评估，以期为精液鉴定提供更科学、准确的方案。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要仪器和试剂 QX200 AutoDG 微滴式数字PCR 系统（美国Bio-Rad 公司），包括自动化微滴生成器、PX1 PCR 反应板热封仪、带96-深孔反应模块的C1000 Touch 热循环仪和QX200TM微滴读取器；NanoDrop 2000c 分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific 公司）。 miRNeasy Mini试剂盒（德国Qiagen公司），TaqManTMMicroRNA逆转录试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司），ddPCR超混合液（无dUTP，美国Bio-Rad公司）。 1.1.2 引物、探针设计与标准品RNA 合成 miR-888、miR-891a 的成熟序列[5]及引物和探针信息见表1，探针的报告基团分别采用6-FAM 和HEX荧光修饰。自行设计引物、探针后由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。miR-888、miR-891a 标准品RNA 由宝生物工程（大连）有限公司合成。 表1 miR-888、miR-891a 的成熟序列及引物和探针信息Tab.1 Information of mature sequences，primers and probes of miR-888 and miR-891a 1.1.3 样本制备 对75 名来自中国北方地区年龄在25～35 岁的健康志愿者进行样本采集，收集5 种法医学相关体液样本共75 份，其中精液35 份，外周血、月经血、唾液、阴道分泌液各10 份。 外周血通过静脉穿刺收集后置于乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝采血管内。 唾液使用无菌塑料管收集（样本收集前志愿者禁食1 h）。 精液使用无菌广口塑料杯收集（样本收集前，志愿者禁欲2 d）。 月经血（于月经周期的第2 天或第3 天采集）和阴道分泌液使用卫生棉条获取。 所有样本采集制备后均储存于-80 ℃备用。 本研究已通过公安部鉴定中心伦理委员会的审查（审批文号：2020-024），所有志愿者均已签署知情同意书。 1.2 方法 1.2.1 RNA 提取和定量 按照miRNeasy Mini 试剂盒操作说明书进行总RNA 的提取[13]，使用NanoDrop 2000c 分光光度计测定总RNA 的质量浓度和纯度（D260/D280）[8]。 1.2.2 互补DNA（complementary DNA，cDNA）合成 采用茎环反转录法[8]，按照TaqManTMMicroRNA逆转录试剂盒操作说明书进行反转录。每15 μL 反应体系包括总RNA 10 ng，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNT