富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞治疗兔股骨头坏死的实验研究.docxVIP

富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞治疗兔股骨头坏死的实验研究 股骨头坏死是股骨头最常见的疾病。它与年轻时相似。病变导致关节软骨和股骨头塌陷，最终导致关节功能丧失。激素、乙醇等各种原因导致的股骨头坏死均以股骨头局部缺血为其最终病理改变,因而如何改变股骨头局部血供、促进血管再生和关节软骨及骨组织形成、保存自体股骨头并防止其塌陷已成为各种治疗的重点。Antonio等研究表明富血小板血浆具有软组织的功能修复和骨组织再生中起到重要的作用,而且富血小板血浆(PRP)内含有多种生长因子,其本身还可作为支架材料、凝固后具可塑性。骨髓间充质干细胞(BMSCs)可以分化为骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞等功能。本研究观察PRP联合BMSCs对兔股骨头坏死的影响,为进一步开发研究提供科学依据。 1 材料表面 1.1 实验动物及动物 正常健康新西兰大白兔,雌雄各半,4个月龄,体重2.6～3.2 kg,由广西医科大学实验动物中心提供,试验动物生产许可证SCXK(桂)2009-0002,试验动物使用许可证SCXK(桂)2009-0005。 1.2 免疫、igg-hrp抑制剂 H-DMEM培养基(北京索来宝,批号,标准胎牛血清[赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司,批号NWJ0473],胰蛋白酶(北京索来宝,批号Lot.,多克隆PDGF抗体(Santa Cruz Biotechnology,批号QD-1303),兔抗羊IgG-HRP抗体(上海江莱生物科技有限公司,批号2013-0218),预染蛋白Marker(西安润德生物技术有限公司,批号RD1301),大肠杆菌内毒素(Sigma 公司,批号L-2630)。 1.3 温度高速离心设备 BH-Z普通光学显微镜(Olympus),Airtech 无菌超净工作台(苏州富泰洁净系统有限公司),低温高速离心机(德国Heraeus),常温高速离心机(美国,Thermofisher),-40 ℃低温冰箱(青岛海尔股份有限公司)。 2 小鼠骨髓组织病理学检测 采用PCCS kit法无菌提取PRP,具体过程为:取5.0 mL新西兰大耳白兔股静脉血加入预先放置10%枸椽酸钠抗凝剂的离心管中,离心3 000 r·min-1,3 min 45 s,吸取上层血浆及血小板,再次离心,3 000 r·min-1,13 min,弃上层清液后与激活剂(凝血酶与10%CaCl2的混合物)适当比例震荡,混匀,静置于4 ℃冰箱过夜,再离心,1 500 r·min-1,5 min,吸出上清液(即为PRP液),调节至3%备用。 取新生兔断颈法处死,医用乙醇浸泡消毒3次,无菌分离兔四肢长股骨干,剔除软组织。分离出股骨与胫骨,并将其表面组织剥离干净,骨两端用剪刀断开,暴露髓腔,采用一次性注射器吸取PBS缓冲液反复冲洗骨髓腔15次,直至骨髓腔呈灰白色。将冲洗液合并置于离心管中,加PBS缓冲液至10 mL,平衡。采用全骨髓培养与差速贴壁分离法培养并纯化BMSCs细胞液,调节细胞密度为1×106/mL。 将50只新西兰大白兔随机分为5组,每组10只:空白对照组、模型组、PRP(3%)组、BMSCs(1×106/mL)组、PRP(3%)和 BMSCs(1×106/mL)联合组。除正常组外其余动物造模。方法为兔静脉注射10 μg·kg-1大肠杆菌内毒素(LPS)2次,注射间隔为24 h。在第2次注射LPS后,臀肌注射甲基强的松龙20 mg·kg-1,注射3次,每次注射间隔为24 h。 术后第4周,分别向PRP(3%)组、BMSCs(1×106/mL)组、PRP(3%)和 BMSCs(1×106/mL)联合组的股骨头内髓芯减压后注射,0.4 mL3%PRP,BMSCs 细胞液(1×106/mL)1,0.4 mL 3%PRP+1 mL BMSCs细胞液(1×106/mL),每周注射1次,连续注射4周。造模12周后,切取股骨头固定、包埋、切片、观察病理学变化。 造模12周后分别处死各组实验兔,采用HE染色对股骨头进行染色,光镜下观察骨髓腔内骨小梁结构和骨细胞、脂肪细胞的变化情况。 提取各组兔子骨髓组织100 mg,15 000 r·min-1离心5 min,沉淀物中加入0.02 mL裂解液,混匀。取蛋白样品,上样每孔上样量为15 μg,同时上样Marker。取出PVDF膜,用洗膜液洗10 min。将膜浸入5%的脱脂奶粉中,封闭过夜。用杂交液稀释抗体,PDGF为1∶1 000,将膜浸入抗体中,室温摇床上反应2 h。取出PVDF膜用洗膜液洗3次,每次10 min。加入二抗孵化反应,稀释抗体为1∶2 000,将膜浸入抗体中,室温摇床上反应2 h。将PVDF放入暗盒,曝光,显影,定影,晾干保存。胶片应用图像分析系统进行分析。 采用SPSS