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柴胡疏肝散对围绝经期综合征肝郁证大鼠海马区雌激素受体er,er,gpr 更年期综合征是指更年期前后的卵巢功能萎缩，雌激素水平波动或降低，女性以独立神经系统功能障碍为主，伴有神经心理症状的症状群。中医学称之为“绝经前后诸证”。近年来,许多研究发现围绝经期综合征肝郁证女性的雌激素水平、雌激素受体以及肽类和单胺类神经递质的活性和含量都有明显改变,动物实验亦发现郁证动物海马和下丘脑肽类和单胺类神经递质的变化与其相类似。传统经方柴胡疏肝散能改善围绝经期综合征肝郁证的症状,本研究旨在以“以方测证”的方法研究围绝经期综合征肝郁证发生的生物学机制,探讨雌激素受体表达变化与大鼠海马区神经递质释放的关系。 材料和方法 1. 实验大鼠的分组及饲养条件 选取雌性SD大鼠,SPF级[北京维通利华实验动物中心提供,动物许可证号:SCXK(京)2006-2009],13月龄,48只,体质量370-380g;3月龄12只,体质量250-280g。13月龄组大鼠持续30d作阴道涂片,用95%酒精固定,5%碱性美蓝溶液染色5min,吹干,镜检,呈现无持续动情5d以上大鼠作为围绝经期模型鼠,将其随机分为对照组(B组)、对照加中药组(C组),围绝经期综合征肝郁证加中药组(D组)、围绝经期综合征肝郁证组(E组),每组12只。另选3月龄、有规则的动情周期、平均体质量达250-280g的雌性SD大鼠,共12只,作为育龄期空白对照组(A组),与其余各组相同条件饲养。饲养条件:分笼,每笼2只,于昼夜颠倒环境(每日21∶00开灯,9∶00关灯),除实验期外自由饮食、饮水。所有实验操作均在夜间、暗淡红灯下进行。实验过程中对动物处置符合中华人民共和国科学技术部颁布的实验动物管理条例的规定。 2. 模型准备和评估 2.1 动情周期观察、药物干预和等体积、钠 围绝经期综合征大鼠造模方法用自然衰老方法;肝郁证大鼠造模方法采用慢性束缚应激方法,采用旷场实验检测大鼠情绪、行为变化以判定造模是否成功,造模时间为3周。经适应性饲养1周后,每日6h,束缚时间点随机。同时进行动情周期观察,选取连续5d不出现动情期的动物进行实验,中药干预组大鼠给予研究团队前期研制的柴胡疏肝散(《景岳全书》原方原剂量组方:柴胡6g,白芍4.5g,枳壳4.5g,川芎4.5g,醋炒陈皮6g,香附4.5g,炙甘草1.5g)水溶液每日灌胃1次(每毫升药液含原生药1g,剂量1m L/100g体质量)。剂量均按临床成人剂量的8倍计算,其余大鼠给予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃。药物干预3周后处死。 2.2 静置-离心制备 第22天时,所有大鼠空腹戊巴比妥(1m L/100g)麻醉,腹主动脉采血,将获取的新鲜血液于4℃冰箱静置6h后,以3 000r/min室温离心10min,取血清,标记后置-70℃低温冰箱中备存;所有大鼠在冰上剥离大脑,迅速分离海马,置冷冻管标记后,立即投入液氮中备用,以防止海马组织内部RNA降解。 3. 试剂和设备 3.1 分离、n-n酶联免疫试验剂及检测仪器 海马组织匀浆后3 000r/min,4℃离心15min,取上清液,参照大鼠5-HT、β-END、NE酶联免疫分析试剂盒(购自武汉华美公司)说明书进行,检测仪器:EIX808U型全自动酶标仪(美国Bio Tek GC-2010型)。Gene Amp PCR System 9700(Applied Biosystems),引物设计软件:Primer 5.0]。 3.2 实际pcr反应 用TRIZOL法抽提海马组织总RNA,海马组织总RNA的质量判断使用紫外吸收测定法和变性琼脂糖凝胶电泳法测定RNA浓度和纯度。合成c DNA,将所有c DNA样品分别配置Real-time PCR反应体系。体系:(1)2×Master Mix5μL、10μmol/L的PCR特异引物0.5μL加水至总体积为8μL,轻弹管底将溶液混合,5 000r min短暂离心。(2)加样。a.将8μL混合液加到384-PCR板对应的每个孔中;b.再加入对应的2μL c DNA;c.小心粘上Sealing Film封口膜,并短暂离心混合;d.在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。(3)将上述384-PCR板置于Real-time PCR仪上进行PCR反应。反应条件:95℃,10min;40个PCR循环[95℃,10s;60℃,60s(收集荧光)]。为了建立PCR产物的熔解曲线,扩增反应结束后,按(95℃,10s;60℃,60s;95℃,15s);并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行,Ramp Rate为2%)。各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime quantitative PCR反应,见表1。m RNA相对表达量以2-△△Ct表示,△Ct=(Ct ER-Ct GAPDH)