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栀子大黄汤的入血成分及药效物质研究 传统中医通常采用口服给药法，口服后药物所含的成分或直接通过胃肠道血液吸收。或者通过消化酶、消化酶和肠道内菌群的作用，将其分解成二次代谢产物，并将其转化为血液。或者肝脏微粒体酶的代谢是活性代谢产物。无论经过上述哪一种途径, 其有效物质必须以血液为媒介输送到靶点, 才能发挥相应的药效, 因此, 被吸收入血的成分才是中药的体内直接作用物质。基于以上理论, 日本学者田代真一于1988年提出了“血清药物化学”的概念。近年来, 血清药物化学研究方法引起了众多研究者的重视, 并广泛将其运用于中药药效物质基础研究, 显示出了很好的应用前景。 栀子大黄汤 (Zhizi Dahuang Decoction, ZDD) 始载于《金匮要略》, 由栀子、大黄、枳实、淡豆豉4味中药组成, 是张仲景治疗酒黄疸的经典名方, 现代临床应用广泛, 对于酒精性肝炎、黄疸型肝炎、急慢性肝炎、急性胰腺炎、心系重症等具有确切疗效。本实验室前期利用超快速液相色谱 (UFLC) 方法建立了ZDD的指纹图谱, 但尚未见有关该方血清药物化学方面的研究。因此, 本实验在前期体外分析的基础上, 建立ZDD大鼠血清指纹图谱, 初步确定其入血成分及其来源, 从而为深入研究ZDD的效应物质奠定基础。 1 材料表面 1.1 仪器、试剂和仪器 日本岛津LC—30AD UFLC色谱仪系统, 包括二元高压梯度泵、在线真空脱气机、自动进样装置、SPD—20A型紫外检测器、柱温箱, Lab Solutions色谱工作站;KQ—250DB数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司) ;AB135—S十万分之一天平 (瑞士Mettler Toledo仪器有限公司) ;TGL—16高速台式冷冻离心机 (沈阳杰龙仪器有限公司) ;XW—80A旋涡混合器 (上海医科大学仪器厂) ;MTN—2800D氮吹浓缩仪 (天津奥特赛恩斯仪器有限公司) ;VFD—2000真空冷冻干燥机 (北京博医康实验仪器有限公司) 。 1.2 药物、药物和药物 色谱用乙腈和甲醇均购自美国Fisher公司, 色谱用甲酸购自天津市科密欧化学试剂有限公司, 水为二次蒸馏水, 其他试剂均为分析纯。 对照品京尼平苷 (批号110749-201115) 、芦荟大黄素 (批号110795-201007) 和大黄酸 (批号110757-200206) 购自中国食品药品检定研究院, 质量分数均大于98%。 栀子、大黄、枳实、淡豆豉药材均购自沈阳天益堂药店, 经沈阳药科大学中药学院袁久志副教授鉴定栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实, 大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.的干燥根和根茎, 枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.的干燥幼果, 淡豆豉为豆科植物大豆Glycine max (L.) Merr.的成熟种子的发酵加工品。 1.3 实验动物中心提供 雄性SD大鼠, 清洁级, 体质量 (200±20) g, 由沈阳药科大学实验动物中心提供, 实验动物生产许可证号SCXK (辽) 2010-0001。将实验动物置于昼夜节律光照条件下, 自由进食进水, 室温在18~22℃, 饲养1周以适应环境, 每日触摸动物以适应实验人员的操作。 2 方法 2.1 zdd冻干粉样品的制备 参照《金匮要略》原文, 折合成现代剂量, 按栀子-大黄-枳实-淡豆豉3∶1∶4∶8称取栀子 (GJE) 9 g、大黄 (RPL) 3 g、枳实 (CAL) 12 g、淡豆豉 (SSP) 24 g, 用10倍量水浸泡30 min后, 回流提取1 h, 纱布滤过, 药渣加10倍量水重复提取1次, 合并2次滤液, 经冷冻干燥制成ZDD冻干粉样品, 密封置于干燥器中, 备用。同法制备5批ZDD冻干粉样品, 编号S1~S5, 并计算各批次样品的出粉率 (样品出粉率=所得冻干粉质量/生药总质量) 。取ZDD冻干粉0.1 g (相当于生药约0.33 g) , 精密称定, 置50 m L具塞碘量瓶中, 加甲醇25 m L, 称定质量, 超声提取30 min后, 放冷, 再次称定质量, 并用甲醇补足减失的质量, 提取液经13 000r/min离心10 min, 上清液用0.22μm微孔滤膜滤过, 取续滤液作为体外供试品溶液。另按上述方法分别制备各缺味方及单味药的冻干粉样品及其体外供试品溶液。 2.2 对照品储备液的制备 称取京尼平苷、芦荟大黄素和大黄酸对照品适量, 精密称定, 分别置于5 m L量瓶中, 加甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 得各对照品储备液;精密吸取各对照品储备液适量, 置于同一10 m L量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀, 配制成质量浓度分别为京尼平苷500μg