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虫草素对结肠癌细胞增殖和迁移能力的影响 草地昆虫素是牧草最重要的生理活性成分。传统医学认为:冬虫夏草性平味甘,入肺、肾二经,“肺与大肠相表里”。研究显示北冬虫夏草具有提高免疫力和抗肿瘤的作用。但是冬虫夏草的主要有效成分虫草素是否同样具有预防和治疗结肠癌的作用及其作用机制引起广泛关注。本研究运用血清药理学的方法,给BALB/c裸鼠分别喂饲虫草素或同体积生理盐水后处死取血清,将各组血清分别或联合顺铂在体外与人结肠癌细胞株SW1116共培养,研究虫草素对结肠癌细胞的增殖、迁移能力的影响,及其诱导肿瘤细胞凋亡的作用。 材料和方法 一、 动物房标准饲养 6~8周龄大BALB/c雌性裸鼠,体重20 g左右,由中国科学院上海生物化学和细胞生物学研究所动物房提供,在复旦大学上海医学院动物房SPF条件下标准饲养。人结肠癌细胞株SW1116由上海消化外科研究所保留传代。 二、 细胞毒性检测 虫草素(北冬虫夏草提取)由中国国宝生物研究所提供,生产批号RPMI1640培养液(杭州吉诺生物医药技术有限公司);顺铂(齐鲁制药有限公司);CCK-8细胞増殖/细胞毒性分析试剂盒(中国碧云天生物技术研究所);Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒(中国碧云天生物技术研究所);Hoechst 33258荧光检测试剂盒(中国碧云天生物技术研究所);Safire 2型多功能酶标仪(瑞士Tecan公司);U-SPT荧光显微镜(Olympus,日本);H-500透射电子显微镜(Hitachi,日本);BD Calibur流式细胞仪(BD Biosciences,美国)。 三、 连续给药4d剂量l 选用 6~8周龄BALB/c雌性裸鼠20只。随机分为虫草素组和空白对照组,每组10只。虫草素组:按1000 mg·kg-1·d-1的量,每日喂饲虫草素配制液0.3 ml(每0.3 ml含20 mg虫草素);空白对照组:每日喂饲生理盐水0.3 ml。各组裸鼠连续喂饲3 d,末次给药后1 h处死小鼠取血。为避免溶血,将每只小鼠血液分别离心取上层血清后,再将同组血清混合,-80 ℃保存备用。 四、 组和处理 1. 组 取处于对数生长期的SW1116肿瘤细胞,随机分为四组:虫草素组、化疗组、虫草素+化疗组、空白对照组。 2. 增设保养剂为抗菌素联合化疗组edta的细胞培养 CCK-8试剂盒以一种新的四唑盐为底物,经细胞代谢产生水溶性甲瓒产物,可直接用酶标仪检测450 nm和630 nm吸光度值(OD值),OD值与活细胞数量成正比。取处于对数生长期的SW1116肿瘤细胞,用0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化后计数,以100 μl/孔(5000个细胞)接种于96孔培养板,各组分别加入下列处理因素:(1)虫草素组:将喂饲虫草素的裸鼠10份血清混合后取1/200的量(0.119 μl)加入该组肿瘤细胞;(2)化疗组:以顺铂0.001 mg+空白对照组血清10份混合后的1/200的量(0.1 μl)加入该组肿瘤细胞;(3)虫草素+化疗组:将喂饲虫草素的裸鼠10份血清混合后取1/200的量(0.119 μl)+顺铂0.001 mg加入该组肿瘤细胞; (4)空白对照组:空白对照组血清10份混合后的1/200的量(0.1 μl)加入该组肿瘤细胞。 上述各组加样后将96孔培养板放入CO2培养箱培养。分别在培养0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h后,以CCK-8 法检测细胞增殖抑制作用。 3. 细胞培养和样品前处理 肿瘤细胞悬液制备:各组细胞弃去原培养液,无菌PBS液洗涤以充分除去死亡细胞,以新鲜的无血清培养液重悬细胞并计数,调整细胞悬液的浓度至 5×105个细胞/ml。分别加入下列各处理因素:(1)虫草素组:将虫草素组10份血清混合后取1/100的量(0.238 μl)加入该组肿瘤细胞;(2)化疗组:以顺铂0.002 mg+空白对照组血清10份混合后的1/100的量(0.2 μl)加入该组肿瘤细胞;(3)虫草素+化疗组:将虫草素组10份血清混合后取1/100的量(0.238 μl)+顺铂0.002 mg加入该组肿瘤细胞;(4)空白对照组:空白对照组血清10份混合后的1/100的量(0.2 μl)加入该组肿瘤细胞。 每组细胞200 μl(1×105个细胞/孔)加入Transwell小室的上室,下室中加入600 μl含10%小牛血清的RPMI1640培养液。细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。弃去上室中的培养液,取出小室,吸弃上室液体,用棉签仔细擦净膜上未迁移的细胞,取下上室底部的膜。37 ℃预温的 PBS液漂洗两次,4%多聚甲醛固定,Giemsa染液染色。显微镜200×视野下任取6个不重复视野,拍照计数。以上实验重复2