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银杏内酯b及其前药脂水分配系数测定方法的研究 银杏籽是提取银杏叶片的主要有效成分，包括银杏籽a、b、c、j、m等。现代药理研究表明,银杏内酯均是天然的血小板活化因子(platelet activating factor,PAF)受体拮抗剂,其中银杏内酯B(GB)活性最强。此外,GB还具有抗脑缺血、抗氧化、抗菌抗炎、抗过敏和抗休克等作用。 药物在体内溶解、吸收、分布、代谢与药物的水溶性和脂溶性密切相关,即和脂水分配系数(log P)相关,尤其是治疗脑部疾病的药物。为增加GB的脂溶性,提高通过血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的能力,本实验室设计并合成了GB前药(PGB),结构(见图1)。有关银杏内酯及其前药脂水分配系数的测定,文献中未见相关报道。借鉴其它化合物测定方法[9,10,11,12,13,14,15],本文采用摇瓶法及高效液相色谱法(HPLC)测定GB及其前药脂水分配系数,对比二者脂溶性差别,验证结构改性对脂溶性的影响,为后续结构修饰及其它药学研究奠定基础。 1 试验设备及仪器 高效液相色谱仪,配有515高压泵、2420蒸发光散射检测器 (ELSD)、2487紫外光谱检测器 (UVD)、996二极管阵列检测器 (PDA)、Empower数据处理系统(美国Waters公司);Mettler Toledo AG135电子天平(德国METTLER公司);HQ45Z恒温摇床(武汉中科科仪技术发展有限责任公司);XW-80A微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司);SC2201超声仪(上海小岩工贸发展有限公司);DHG-92021SA电热恒温干燥箱(上海三发科学仪器有限公司)。 GB及PGB(纯度99%,由农产品生物化工教育部工程研究中心提供);超纯水;甲醇、四氢呋喃、正辛醇、正丁醇、醋酸乙酯(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)。 2 方法和结果 2.1 gbpgb溶液的配制 室温条件下,将正辛醇与二次蒸馏水于恒温摇床中振荡24 h至相互饱和,静置过夜分层,两相分离。用正辛醇(二次蒸馏水饱和的)分别配制1.0 和 0.1 mg/ml 的GB﹑PGB溶液。上述溶液都应避光保存备用。 2.2 hplc-uvd法 色谱柱为Symmetry ShieldTMRP18 (3.9 mm×150 mm,5 μm);流动相为GB:甲醇:四氢呋喃:水=28:15:57,PGB:甲醇:四氢呋喃:水=43:15:42(V/V/V);检测器种类及参数:GB:Waters 2420蒸发光散射检测器,氮气25 psi,漂移管温度55℃,增益100.00%,喷雾器级别60%,PGB:Waters 2487紫外光谱检测器,波长 288 nm;柱温25 ℃;流速0.8 ml/min;进样量10 μl。 GB甲醇溶液、GB正辛醇溶液、GB饱和水溶液按上述色谱条件进样检测(见图2)。由图2可知,3种溶液GB保留时间均适宜且相互一致,峰形正常,说明此方法适用于GB的脂水分配系数测定。 PGB甲醇溶液和PGB饱和水溶液按GB的色谱方法进样(见图3)。由图可知,PGB甲醇溶液中PGB物质峰保留时间适宜,峰形较好;而PGB饱和水溶液在相同条件下未得到对应色谱峰。因此,HPLC-ELSD不适用于测定PGB脂水分配系数。考虑到PGB具有紫外吸收,故可采用HPLC-UVD测定脂水分配系数。对PGB甲醇溶液进行紫外吸收全波长扫描(见图4)。由图可知,PGB在λ=288 nm处有最大吸收,选为紫外检测波长,得到PGB饱和水溶液紫外色谱图,检测效果良好。在上述色谱条件下,GB和PGB的保留时间分别为6.990 min,9.658 min。 2.3 线性关系及线性回归分析 用甲醇分别配制0.5 mg/ml的GB和PGB标准母液,并稀释得10,20,50,100,200 μg/ml的系列标准溶液。以GB质量浓度C(μg/ml)对数值为横坐标,峰面积A对数值为纵坐标进行线性回归(n=6),得回归方程为:lgA =1.209 lg c+3.448,r=0.998 9;以PGB质量浓度c(μg/ml)为横坐标,峰面积A为纵坐标进行线性回归(n=6),得回归方程为:A=20 357C-32 048,r=0.999 8。结果表明GB和PGB在10～500 μg/ml内呈良好的线性关系。以色谱峰信噪比大于3为标准,在上述色谱条件下GB和PGB的最低检测限为10 μg/ml,5 μg/ml。 2.4 进样精密度试验 分别取质量浓度为50 μg/ml GB甲醇溶液和PGB甲醇溶液,按上述色谱条件连续进样6次,测定计算RSD分别为0.15%、0.89%,均小于药典规定的2%,表明方法精密度符合要求。 2.5 u3000定了正辛醇溶液中gb含量低且添加量低的原因长 分别取10 ml