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曼氏无针解决办法sigma-型gs基因克隆及表达 曼的无针虱子属于软体动物科。它是20世纪70年代以前中国的主要海拔高度之一。然而，由于过度捕获和生态环境的变化，资源如此之累（叶素兰等人，2008）。2004年, 宁波大学蒋霞敏教授和王春琳教授承担的曼氏无针乌贼人工繁殖和养殖试验的研究课题取得成功 (全真, 2004;宁成, 2005) ;宋微微等 (2009) 研究了养殖对曼氏无针乌贼群体遗传多样性的影响。在分子生物学研究方面, 曼氏无针乌贼的研究还刚处于起步阶段, 仅见蒋霞敏等 (2011) 构建了其肌肉c DNA文库, 周超等 (2012) 报道了曼氏无针乌贼ALSM基因的克隆。 谷胱甘肽硫转移酶 (GST) 是广泛存在动植物及微生物中的一个主要的解毒酶家族, 能催化还原型谷胱甘肽 (GSH) 和亲电子类化合物结合 (Hayes et al, 1995;Sheehan et al, 2001) 。哺乳动物中目前报道的GST主要分为alpha-型、pi-型、mu-型、theta-型、kappa-型、zeta-型和omega-型几种不同类型 (Mannervik et al, 1992;Pemble et al, 1996;Board et al, 1997;) 。软体动物中, Delta-型 (Zhao et al, 2010) 、omega-型 (Wan et al2009) 、pi-型 (Hu et al, 2012) 、theta-型 (Rhee et al2007) 、sigma-型 (Ren et al, 2009) 和mu-型GST (Rhee e al, 2008) 都有报道。本研究以实验室前期构建的曼氏无针乌贼全组织c DNA文库中筛选出的EST序列为基础, 通过RACE技术获得了曼氏无针乌贼谷胱甘肽硫转移酶基因的全长序列。采用体外重组表达技术获得了谷胱甘肽硫转移酶基因的重组表达产物, 检测了重组蛋白的活性, 以期为曼氏无针乌贼功能基因开发及抗氧化系统研究提供技术基础。 1 材料和方法 1.1 总rna提取 实验用曼氏无针乌贼购自福建霞浦, 体重为15—20g。曼氏无针乌贼活体取样获取肌肉、肝脏、性腺、眼睛等组织, 经过液氮研磨后加入Trizol (Invitrogen公司) , 按照试剂盒操作说明进行总RNA提取。c DNA合成在20μl反应体系中进行, 其中包含:1μg RNA (经DNAase处理) , 50mmol/L Tris-HCl, p H 8.3, 75mmol/L KCl, 3mmol/L Mg Cl2, 50mmol/L DTT, 75U Rnasin, 0.2mmol/L DNTPs, 200U M-MLV逆转录酶 (Promega) 。 1.2 eri特异性引物的筛选 曼氏无针乌贼全组织c DNA文库为实验室前期构建, 从中发现1条EST序列 (长度为437bp) 与栉孔扇贝Chlamys farreri的GST (ACF25904.1) 的5′末端相似较高 (identity为48%) , 因此, 在该EST的基础上设计特异性引物 (5′CTTAGCGAAGGAGTGAAGACA TA 3′) 与Oligo (d T) (5′GGCCACGCGTCGACTAGTAC T17 3′) 进行3′末端扩增。新获得的序列与该EST序列通过Vector NTI Suite 8软件进行拼接得到全长序列。 1.3 系统构建过程 采用BLASTP () 软件将翻译得到的氨基酸序列于NCBI上, 寻找同源蛋白序列, 所得的同源蛋白序列用CLUSTAL W程序进行处理, 然后运用MEGA4.1软件包 (Kumar et al, 2008) 的Neighbor-joining法进行系统树构建, Bootstrap值为1000。 1.4 gst的重组表达 根据所得到的Sm GST的c DNA编码区设计特异性引物 (5′CATATGGCGAAGTATACACTTAATTATT 3′, 含有NdeⅠ酶切位点) 和 (5′CTCGAGTTAGTGGTGGT GGTGGTGGTGAAAATCGGTGACGGGA 3′, 含有XhoⅠ酶切位点和6×His纯化标签) 进行GST体外重组表达。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳纯化后连入p MD18-T载体, 转化Top10F’感受态细胞, 通过特异性PCR进行阳性克隆筛选。培养经测序验证后的阳性克隆进行质粒提取并NdeⅠ和XhoⅠ双酶切, 纯化后连接到p ET21 (a+) 表达载体, 转化大肠杆菌origami (DE3) 感受态之后, 通过测序验证。 1.5 重组蛋白的纯化和浓度测定 确定宿主菌所表达的蛋白中含有可诱导的目的蛋白Sm GST后, 在200ml L