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犬冻精技术研究的回顾与展望 对动物育种和人类疾病的技术研究始于18世纪。1780年，意大利生理学家协会成功地进行了对大鼠的新鲜精华的人工培训。母狗6个月大后，有两只公狗和一只母狗，共有3个后代。1969年,Seager首次报道了犬的冻精人工授精试验成功,之后,又相继建立了有关精液品质、冷冻等一系列参数。1976年,武石昌敬等也报道了犬冻精人工授精的成功。美国养犬俱乐部(AKC)早在20世纪70年代即投入了大量的资金用于人工授精研究,并详细制定了人工授精各主要环节的操作规程;同时规定,从1981年起,只有经过AKC审验合格的配种站才能提供犬的冷冻精液。 我国在该方面的研究起步较晚,目前尚处于试验研究阶段。1985年,潘寿文等对德国牧羊犬的冻精及人工授精进行研究,输精9头母犬,2头怀孕,平均窝产仔2头;1988年,洪振银等用冻精为9头母犬输精,受胎产仔结果同上;1991年,王力波等对德国牧羊犬的冻精研究也获成功,输精5头,4头怀孕,平均窝产仔7头;1993年,安铁沫等对比格犬的冻精进行研究获得成功,冻后精子活力达0.4以上;1998年,刘海军等对德国牧羊犬冻精进行研究,结论为在最优条件下,解冻后精子活力为0.47,复苏率为52.2%,存活时间为8.23 h,存活指数为1.08,顶体完整率为43%。 纵观国内外的同类研究可以发现:自然交配时犬的平均受胎率可达87%~90%,而用解冻后的冻精AI时的受胎率却有高有低,从20%至80%不等,亦即其总体趋势是用冻精AI的受胎率较本交要低,且窝产仔数较少。影响犬冻精AI成败的因素众多,主要有采精的方法、原精品质、稀释液的配方及稀释方法、冷冻的方法和速率、解冻的方法及解冻后冻精的品质、输精的时间、部位、器械及方法等因素。 1 收集狗舌头，检测精子质量的现状及进展 1.1 主人的精子收集 目前,国内外报道的警犬精液采集主要有按摩采精法、假阴道采精法、电采精法、点振动仪采精法4种。 1.1.1 u3000种植丰隆穴 根据相关报道,渊剔藩、刘健、张旭秋、England GCW等对按摩采精法都进行过研究报道。总之,按摩采精法简单易行,且容易将射精的3个阶段分开,有利于精液的收集,但缺点则是如果精液收集时机掌握不当,容易造成精液的漏接。 1.1.2 假阴道法 据England GCW等报道,假阴道采精法中使用的润滑剂及乳胶对精子均有不利影响,特别是对精子的损伤较大,容易使精子的畸形率上升。 1.1.3 采精法 电采精法是通过电流刺激公犬射精中枢而引起射精,电振动仪法是将配有特殊的集精杯装置的振动仪杯安装在公犬阴茎头进行采精,由于上述2种方法需要专门的仪器设备,且易使公犬发生休克,同时精液中易混有尿液,效果不甚理想,一般不予采用。 1.2 主人对狗精质量的评估 1.2.1 感官评定指标 外观检查法是通过感官对精液品质进行初步评定的方法。评定指标包括射精量、色泽和云雾状等项目。王立波、安铁沫、沈伟等分别对不同品种的犬进行射精量等项目进行检查,研究发现各品种之间射精量等项目存在着差异。 1.2.2 生存指数的测定 精液显微镜检查的项目主要包括精子活率、密度、形态,观察记录存活时间并计算生存指数等。显微镜检查法由于受评定者的主观影响强,其准确性只能依赖于操作者的经验。 1.2.3 ph值对精子密度和活力的影响 生物化学检查法的主要检查项目包括精液p H值、精子耗氧量、美蓝褪色试验、果糖分解等。p H值与精子密度和活力存在一定的负相关,同种精液以p H值偏低为好。由于生物化学检查法建立于精子的某些代谢特性基础之上,而高代谢力的精液不能直接反映出其有高受胎力,因此,生物化学检查法的使用范围受到一定程度的限制。 1.2.4 精子的缓冲能力 精子抗力检查法包括精子对酸碱滴定、1%氯化钠滴定的抵抗力和抗冷打击能力。在20世纪40年代曾有人用0.1 mol/L硫酸滴定精液直到精子停止活动以测定精液的缓冲能力。前苏联曾用精子对1%氯化钠溶液的抵抗力测定其抗力系数。Salisbury等认为,冰水中精子的抗冷打击试验虽然是家畜精液品质评定的古老方法之一,但其评价指标似与受精力的潜在关系较为密切。 1.3 应用计算机精子分析技术 为了使精液品质评定方法更接近于实际并为日益普及的人工授精等生产实践所采用,一般传统评定方法采取外观检查、活率检查、形态和存活率检查等综合判断精液品质。随着试验手段的进步,发展了检测质膜完整性、顶体完整性、线粒体活性以及获能与AR的荧光探针等技术,在家畜精液品质评定中具有较高的应用价值。但所需仪器昂贵,因而限制了上述方法在生产中的推广应用。利用荧光显微镜可以进行人工计数,但只有较少的精子被分析,而且人为的主观因素影响了其准确性。直到目前仍没有一种体外方法能够准确评价精子的功能状态,必须几种方法结合使用才具