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细胞内骨架系统在细胞内骨架中的表达 细胞的癌机随着细胞功能和形态的变化而变化。现在，对肿瘤内细胞骨架的分析已成为肿瘤治疗和肿瘤药物研究的重要指标之一。通过分析药物对肿瘤细胞内微丝骨架的作用,研究抗癌药物的作用机制。本研究对细胞内微丝骨架与癌细胞的形态进行观察,并以Cyt-B处理人肝癌Bel-7402细胞内微丝骨架等实验,探讨细胞内微丝骨架改变对癌细胞形态变化及迁移能力的影响。 1 材料和方法 1.1 d培养箱培养 人肝癌Bel-7402细胞株(来自中国科学院上海细胞生物学研究所 )接种于含10%小牛血清,100μ/ml 青霉素及100μ/ml 链霉素的RPMI1640培养基中,在37℃,含5%的CO2培养箱中培养传代。将细胞接种在Petri皿内,培养24小时后, 观察细胞生长状况, 当癌细胞生长占皿底面积底80 %左右,用0.15 mol/L磷酸缓冲液(phosphate buffer saline ,PBS, pH 7.2) 洗净培养基;或使用6μg/ml细胞松弛素-B (Cyt-B, Sigma Chemical.Com. USA) 处理细胞,继续培养24小时后, 用PBS洗去培养基。4 %多聚甲醛固定30分钟,PBS洗涤2次,待用。 1.2 细胞内f-actin表达 细胞经0.2 %Triton X-100室温处理10分钟,PBS洗涤2次,加入2μg/ml鬼笔环肽(phalloidin)-FITC(Sigma Chemical.Com. USA)标记细胞内F-肌动蛋白(F-actin),室温暗处1h;或4℃过夜。PBS洗涤2次,20μg/ml RNase 处理10分钟, 5μg/ml碘化丙碇(propidium iodide, PI. KPL.Co.USA)标记细胞内DNA, 室温暗处30分钟,PBS洗涤2次,甘油封片。 1.3 亚离子激光检测细胞的形态 将细胞标本正面倒置于激光扫描共聚焦显微镜( ACAS Ultima-312, Merindian. Com. USA) 的载物台上,在光学显微镜(100×, NA 1.3物镜)下寻找细胞。使用共聚焦显微镜的氩离子激光(激发波长分别:488±10nm 、514±10nm 、355±30nm 和500±40nm)扫描细胞,对细胞形态进行定位及结构分析。利用亚离子激光逐层扫描方法,形成一系列共聚焦扫描图像。见图:FITC 激发波长494nm, 发射518 nm,显示绿色荧光;PI激发波长535nm, 发射617nm,显示红色荧光。 2 结果 2.1 纤维束状结构 微丝聚集分布于细胞膜内侧及细胞核外测,形成粗大的较长的束状纤维,处于附着支持物上的细胞内纤维呈粗大的束状结构,大量纤维横贯细胞内部,颗粒状(或称小体)的F-actin散在细胞内;远离支持物表面的细胞内束状纤维较细,束状纤维仅分布于细胞核外测(见图1 A)。 2.2 一些癌细胞呈椭圆形或圆形 癌细胞位于附着在支持物表面细胞的上层,细胞内微丝缩短形成较短的束状纤维及颗粒状的F-actin小体(见图1B和图1C的部分细胞) 2.3 f-actin的散在细胞内,细胞外测和细胞内 使用Cyt-B处理癌细胞可破坏细胞F-actin, 形成颗粒状(或称小体)的F-actin散在细胞膜内侧,细胞核外测及细胞质内。核分裂,而细胞质不分裂,形成双核细胞,细胞形态趋于圆形(见图1D)。 3 cyt-b对k-ras-b细胞毒性的机制 微丝是细胞骨架结构的重要组成部分,细胞通过微丝肌动蛋白的聚合与解聚得以向一定的方向运动,并将细胞外环境的信号传导到细胞内,是细胞信号转导的中间途经。有研究表明:肿瘤细胞在浸润转移的过程与细胞骨架结构的变化密切相关,肿瘤细胞与正常细胞的细胞骨架有明显的差异,细胞骨架的异常改变已成为反映肿瘤细胞的恶性的生物学行为的特征之一。特别是细胞内微丝束的破坏及F-actin小体的重组出现与转化细胞和动物肿瘤的高转移性明显相关。 Bel-7402细胞是一株人肝癌细胞株,具有典型的肝癌特征。Bel-7402细胞的细胞形态及恶性的生物学行为与细胞内微丝骨架的改变相关。从本实验图1B, 图1C可见, 部分细胞其位置处于贴壁细胞的上层,呈脱离上浮的状态,细胞收缩变椭圆或圆形,细胞内微丝缩短形成较短的束状纤维,或出现F-actin小体颗粒, 以细胞膜的内侧较为明显。其下层的贴壁细胞伸展呈梭形,微丝集中分布细胞膜内侧及细胞核外测,形成粗大的较长的束状纤维,处于附着支持物上的细胞内纤维呈粗大的束状结构,呈现出强大的附着能力。 共聚焦图像显示:细胞收缩变椭圆或圆形, 并易于脱离附着的支持物。其现象可能与细胞内F-actin收缩形成较短的束状纤维或颗粒状的F-actin小体出现存在一定的关系。就此原因,本实验利用Cyt-B破坏细胞F-acti